Dokument: TGF-ß1- und IL-6-vermittelte Modifikationen des Sarkomerproteins Titin im Kontext des Myokardinfarkts
| Titel: | TGF-ß1- und IL-6-vermittelte Modifikationen des Sarkomerproteins Titin im Kontext des Myokardinfarkts | |||||||
| Weiterer Titel: | TGF-ß1- and IL-6-mediated modifications of the sarcomere protein Titin in context of myocardial infarction | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65633 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240429-110906-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Heiden, Linda [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. rer. nat. Krüger, Martina [Gutachter] Prof. Dr. med. Schmitt, Joachim [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Titin | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Der ischämiebedingte Zelluntergang führt zum Funktionsverlust des infarzierten Myokards und zur Ausbildung einer Infarktnarbe. Um diese zu stabilisieren und die Kontraktilität der Ventrikel aufrecht zu erhalten, kommt es im Rahmen des kardialen remodelings auch zu Anpassungsmechanismen des nicht infarzierten (remote) Myokards. Ein Teil der akuten postischämischen Adaptation erfolgt durch Modifikation des Makroproteins Titin, welches als molekulare Feder im Sarkomer der Herzmuskelzellen fungiert und eine dynamische Regulation der passiven Myokardsteifigkeit vermittelt. In der Herzmuskulatur werden zwei verschiedene Titinisoformen exprimiert. Das exprimierte Verhältnis der elastischeren N2BA-Isoform zur steiferen N2B-Isoform reguliert die Titin-basierte Zellsteifigkeit und unterliegt Veränderungen bei kardialen Erkrankungen. Dynamischer kann die passive Steifigkeit durch eine Phosphorylierung der elastischen Titinregionen PEVK und N2B beeinflusst werden. Eine Phosphorylierung in der PEVK-Region erhöht die Steifigkeit der Kardiomyozyten und führt damit zu einer Spannungszunahme, während eine Phosphorylierung in der N2B-Region eine Spannungsabnahme bedingt. Im Mausmodell konnte nachgewiesen werden, dass die Titin-vermittelte passive Steifigkeit in den ersten Tagen nach einem Myokardinfarkt zunimmt und dies durch Zytokine wie Interleukin-6 vermittelt werden kann. Es wird vermutet, dass diese Zunahme die Ventrikelfunktion unterstützt, bis die strukturellen Umbauprozesse innerhalb des Myokards zur Ausbildung einer stabilen Infarktnarbe führen. Etwa 10 Tage nach dem Myokardinfarkt nahm die Titin- vermittelte passive Steifigkeit wieder ab. Ein weiteres Zytokin, das nach einem Myokardinfarkt erhöhte Level im Herzen aufweist, ist Transforming Growth Factor beta 1 (TGF-β1). Es wird circa 72 Stunden nach der Ischämie sezerniert und wirkt im postischämischen Myokard antiinflammatorisch sowie profibrotisch. In der vorliegenden Arbeit wurden der Einfluss von TGF-β1 auf die Expression der Titinisoformen sowie mögliche dynamische Modifikationen durch Phosphorylierung in den elastischen Titinregionen untersucht und die zugrundeliegende Signalkaskade analysiert. Hierfür wurden Zellkulturen embryonaler Rattenkardiomyozyten am siebten Tag nach Präparation für 30 Minuten mit TGF-β1 stimuliert und anschließend Proteine der TGF-β-Signalkaskade mittels biochemischer Methoden (SDS-PAGE und Westernblot) analysiert. Dabei zeigten sich eine signifikante Aktivierung der Serin/Threonin Kinase AKT und der MAP-Kinase ERK 1/2, sowie eine erhöhte Phosphorylierung der N2B-Region an Position S4010. Ferner wurden zur Untersuchung des Isoformenverhältnisses embryonale Rattenkardiomyozyten ab dem 19. Gestationstag für zwei, vier, sieben und neun Tage mit TGF-β1 stimuliert. Hierbei konnte nachgewiesen werden, dass am siebten Tag nach Stimulation prozentual höhere Anteile der steiferen N2B-Bande vorlagen als in den Kontrollzellen, wobei dies durch eine Aktivierung des PI3K-AKT-Signalwegs vermittelt werden könnte. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse, dass TGF-β1 über eine erhöhte Phosphorylierung am Serinrest S4010 in der N2B Region kurzfristig zu einer Abnahme der Zellsteifigkeit führen könnte, während langfristige Stimulationen eine Zunahme derselben durch Steigerung der N2B-Isoform bewirken könnten. Diese Schlussfolgerung kann in zukünftig durchgeführten Kraftmessungen überprüft werden, wodurch auch das Ausmaß auf die kardiale Pumpfunktion abgeschätzt werden kann. Die postischämisch erhöhte mechanische Belastung des Myokards geht mit einem vermehrten Titinabbau über das Proteasom-Ubiquitin-System (UPS) einher. Neben dem Abbau über das UPS existiert für Titin eine weitere Degradationsmöglichkeit über das autophagolysosomale System, das nach einem Myokardinfarkt eine erhöhte Aktivierung aufweist. Vor dem Hintergrund, dass IL-6 die Autophagie induzieren kann, wurden in dieser Arbeit IL-6- vermittelte Einflüsse auf den autophagolysosomalen Titinabbau untersucht. Hierfür wurden embryonale Rattenkardiomyozyten am siebten Kultivierungstag für 30 Minuten mit IL-6 stimuliert und die Autophagiemarker und die Ubiquitinierung des Titins mittels des SDS-PAGE- und Western Blot- V erfahrens analysiert. Die Ergebnisse zeigten eine vermehrte Autophagieinduktion über die Regulatorproteine mTOR und AMPKα. Es zeigte sich jedoch kein Unterschied in der Titin- Polyubiquitinierung am Lysinrest K63. Bezüglich des Autophagiemarkers LC3-II ergaben sich keine Unterschiede zu den Kontrollzellen. Interessanterweise zeigte sich jedoch eine Erhöhung von p62/SQSTM-1, das sowohl bei Autophagieinhibition als auch bei einer Proteasomdysfunktion akkumuliert. Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit vielfältige Einflüsse der postischämisch erhöhten Zytokine TGF-β1 und IL-6 auf die Modifikationen am Titinmolekül nach. Die Ergebnisse bieten neue Ansatzpunkte für weiterführende Studien zur Entwicklung pharmakologischer Interventionsstrategien zum Erhalt der Ventrikelfunktion und damit zur Verbesserung des klinischen Outcomes von Patienten nach einem Myokardinfarkt.Ischemic-induced cell death leads to loss of function of the infarcted myocardium and the formation of an infarct scar. To stabilise this and maintain ventricular contractility, adaptation mechanisms of the non-infarcted (remote) myocardium also occur as part of cardiac remodelling. Part of the acute post- ischemic adaptation occurs through modification of the macroprotein titin, which acts as a molecular spring in the sarcomere of cardiac myocytes and mediates dynamic regulation of passive myocardial stiffness. Two different titin isoforms are expressed in cardiac muscle. The expressed ratio of the more elastic N2BA isoform to the stiffer N2B isoform regulates titin-based cell stiffness and is subject to changes in cardiac disease. More dynamically, passive stiffness and can be influenced by phosphorylation of the elastic titin regions PEVK and N2B. Phosphorylation in the PEVK region increases cardiomyocyte stiffness, leading to an increase in tension, while phosphorylation in the N2B region causes a decrease in tension. In the mouse model, titin-mediated passive stiffness has been shown to increase in the first days after myocardial infarction and this may be mediated by cytokines such as interleukin-6. This increase is thought to support ventricular function until structural remodelling processes within the myocardium lead to the formation of a stable infarct scar. Approximately 10 days after myocardial infarction, passive stiffness mediated by titin decreased again. Another cytokine that shows increased levels in the heart after myocardial infarction is transforming growth factor beta 1 (TGF-β1). It is secreted about 72 hours after ischemia and has anti-inflammatory and profibrotic effects in the post-ischemic myocardium. In the present study, the influence of TGF-β1 on the expression of titin isoforms and possible dynamic modifications by phosphorylation in elastic titin regions were investigated and the underlying signalling cascade was analysed. For this purpose, embryonic rat cardiomyocyte cell cultures were stimulated with TGF-β1 for 30 minutes on the seventh day after preparation and subsequently proteins of the TGF-β signalling cascade were analysed by biochemical methods (SDS-PAGE and Western blot). This revealed significant activation of the serine/threonine kinase AKT and the MAP kinase ERK 1/2, as well as increased phosphorylation of the N2B region at position S4010. Furthermore, to investigate the isoform ratio, embryonic rat cardiomyocytes were stimulated with TGF-β1 for two, four, seven and nine days from gestational day 19. Here, it was shown that on the seventh day after stimulation, higher percentages of the stiffer N2B band were present than in control cells, and this may be mediated by activation of the PI3K-AKT pathway. Taken together, the results indicate that TGF-β1 could lead to a decrease in cell stiffness in the short term by increasing phosphorylation of the serine residue S4010 in the N2B region, while long-term stimulations could cause an increase in the same by increasing the N2B isoform. This conclusion can be verified in future strength measurements, which will also allow for estimation of the magnitude on cardiac pump function. Increased post-ischemic mechanical stress on the myocardium is accompanied by increased degradation of titin through the proteasome ubiquitin system (UPS). In addition to degradation through UPS, there is another pathway for degradation of titin through the autophagolysosomal system, which exhibits increased activation after myocardial infarction. Given that IL-6 can induce autophagy, in this work IL- 6-mediated influences on autophagolysosomal titin degradation were investigated. To do this, embryonic rat cardiomyocytes were stimulated with IL-6 for 30 minutes on the seventh day of cultivation and autophagy markers and titin ubiquitination were analysed by SDS-PAGE and Western blot methods. The results showed increased autophagy induction through the regulatory proteins mTOR and AMPKα. However, there was no difference in titin polyubiquitination in the K63 lysine residue. Regarding the autophagy marker LC3-II, there were no differences compared to control cells. Interestingly, however, there was an increase in p62/SQSTM-1, which accumulates in response to both autophagy inhibition and proteasome dysfunction. In summary, the present work demonstrates multiple influences of post-ischemically elevated cytokines TGF-β1 and IL-6 on the modifications in the titin molecule. The results provide new starting points for further studies to develop pharmacological intervention strategies to preserve ventricular function and thus improve the clinical outcome of patients after myocardial infarction. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Herz- und Kreislaufphysiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 29.04.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 29.04.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 26.10.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 11.04.2024 |
