Dokument: Quantitative secretome analysis of cardiac fibroblasts in the control heart and after myocardial infarction
| Titel: | Quantitative secretome analysis of cardiac fibroblasts in the control heart and after myocardial infarction | |||||||
| Weiterer Titel: | Quantitative Sekretomanalyse kardialer Fibroblasten im Kontrollherzen und nach Myokardinfarkt | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65573 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240424-142808-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Bahr, Jasmin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Schrader, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Gödecke Axel [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Der Myokardinfarkt (MI) ist immer noch eine der führenden Todesursachen weltweit. Insbesondere die Beeinträchtigung der Herzfunktion durch Fibrose, kann zur Herzinsuffizienz (HF) und dem Tod führen und ist ein häufiges Merkmal dieser ischämischen Herzerkrankung. Kardiale Fibroblasten (CF) spielen eine entscheidende Rolle bei der kardialen Umgestaltung nach MI. Es ist jedoch wenig bekannt über CF-sezernierte Faktoren und wie sie als therapeutische Ansätze zur Verhinderung von übermäßiger Fibrose und Herzinsuffizienz genutzt werden könnten.
Um tiefere Einblicke in die Mechanismen der kardialen Umgestaltung und Fibrose zu erhalten, wurde eine Kombination aus stabiler Isotopenmarkierung mit Aminosäuren in Zellkultur (SILAC) und klick-chemiebasierter Proteinanreicherung zur Analyse des CF-Sekretoms in gesunden Kontroll- und post-MI-Herzen (50 Minuten Ischämie/Reperfusion) etabliert. Diese Methode ermöglichte die Anreicherung von neu synthetisierten Proteinen in serumhaltigem (10% FBS) Medium, die mittels Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert werden können. Zusätzlich wurden Einzelzell-/Einzelkern-RNA-Sequenzierungsdaten (scRNA-seq/snRNA-seq) ausgewertet, um die zelluläre Expression der identifizierten Proteine zu untersuchen. Die Sekretomanalyse kultivierter CF unter basal-physiologischen Bedingungen identifizierte 122 Proteine, die neben mehreren extrazellulären Matrix (ECM)-assoziierten Proteinen 57 parakrine/autokrine Faktoren umfassten, die an der Fibrosehemmung (PAI-1, GSN, SFRP1, SLIT2), der Immunhomöostase (AXL, CCL2, SOD3), der Angiogenese (IGFBP4, ANGPTL4, NGF, PEDF) und der Kardioprotektion (IGFBP4, NGF, PCSK6, SFRP1) beteiligt sind. Plasminogenaktivator 1 (PAI-1) zeigte bei weitem die höchste Intensität der parakrinen Faktoren. Die Genexpressionsanalyse (scRNA-seq) zeigte eine hohe Übereinstimmung mit von CF im gesunden Herzen sezernierten Proteinen. CF, die nach MI gewonnen wurden, zeigten eine signifikant höhere Anzahl von 79 Proteinen 3 Tage nach MI und 28 Proteinen 5 Tage nach MI im Vergleich zur Sham-Kontrolle. Einige dieser Faktoren sind bekannt für ihre Förderung der Fibrose (BMP1, LOXL3), Angiogenese (TIMP3, GDF6), Entzündung (SEMA7A), Kardioprotektion (CPE, SFRP1, SLIT2), aber auch für die Apoptose von Kardiomyozyten (PXDN, FN1). Innerhalb der parakrinen/autokrinen Faktoren waren zwei Proteine nur nach MI nachweisbar: Osteoprotegerin (OPG), das die Proliferation von Kardiomyozyten fördert, und das Mitglied B11 der DnaJ-Hitzeschockprotein-Familie (DNAJB11), dessen Funktion bei der kardialen Umgestaltung noch unklar ist. Die scRNA-Analysen ergaben, dass die signifikant höher sezernierten Proteine bevorzugt von CF exprimiert wurden und größtenteils post MI verstärkt wurden. Darüber hinaus wurde versucht, das fibroblastenspezifische Sekretom muriner Infarkt-induzierter aCF in vivo zu studieren, indem AAV9-vermittelte Biotinylierung von POSTN+ CF-sezernierten Proteinen im Herzen verwendet wurde. Hierzu wurde eine ER-lokalisierte Biotin-Ligase (ER-TurboID), die unter Kontrolle eines aCF-spezifischen Promotors (AAV9-POSTN-ER-TurboID) steht, in vivo angewendet, um die dynamischen Veränderungen des durch MI induzierten aCF-Secretoms im koronaren Effluent isolierter perfundierter Herzen zu messen. Die Analyse des POSTN+ CF-Secretoms war durch noch vorhandene Plasmaproteine und eine niedrige Intensitätsverteilung begrenzt. Es wurden jedoch einige ECM-bezogene und parakrine/autokrine Faktoren identifiziert, die post MI auch in der Sekretomanalyse kultivierter CF signifikant erhöht waren. Zusammenfassend sezernieren CF im Herzen nach Infarkt eine Reihe von Matrixproteinen und mehrere parakrine Faktoren, die einen Einfluss auf umliegende Zellen haben können und daher möglicherweise wichtig für die Kardioprotektion und Fibrose sind. Die identifizierten Proteine könnten in der Zukunft therapeutische Ziele zur Begrenzung der kardialen Fibrose sein. Darüber hinaus könnten einige dieser Proteine als Biomarker geeignet sein, um den Aktivierungszustand von CF zu analysieren.Myocardial infarction (MI) is still the leading cause of death worldwide. Especially cardiac fibrosis, which mediates myocardial stiffness and impairs cardiac function resulting in heart failure (HF) and death, is a common feature of this ischemic heart disease. Cardiac fibroblasts (CF) play a crucial role in cardiac remodeling post MI. However, little is known about CF-secreted factors and how they could be used as therapeutic targets to prevent excessive fibrosis and heart failure. To obtain deeper insights into the mechanisms of cardiac remodeling and fibrosis, a combination of stable isotope labeling with amino acids in cell culture (SILAC) and click-chemistry-based protein enrichment to analyze the CF secretome in healthy control and post-MI hearts (50 min ischemia/reperfusion), was established. This method allowed the enrichment of newly synthesized proteins in serum-containing (10% FBS) medium that can be analyzed via liquid chromatography with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Additionally, single-cell/single-nucleus RNA sequencing (scRNA-seq/snRNA-seq) data were evaluated to study cellular expression of the identified proteins. Secretome analysis of cultured CF under basal conditions identified 122 proteins which, besides several ECM-related proteins, included 57 paracrine/autocrine factors reported to be involved in fibrosis inhibition (PAI-1, GSN, SFRP1, SLIT2), immune homeostasis (AXL, CCL2, SOD3), angiogenesis (IGFBP4, ANGPTL4, NGF, PEDF), and cardioprotection (IGFBP4, NGF, PCSK6, SFRP1). Plasminogen activator 1 (PAI-1) was the most abundant paracrine factor by far. Gene expression analysis (scRNA-seq) showed a high degree of agreement with proteins secreted by CF in the healthy heart. CF obtained after MI showed a significantly higher abundance of 79 proteins 3 d post MI and 28 proteins 5 d post MI compared to Sham control. Some of these factors are known to promote fibrosis (BMP1, LOXL3), angiogenesis (TIMP3, GDF6), inflammation (SEMA7A), cardioprotection (CPE, SFRP1, SLIT2), but also apoptosis of cardiomyocytes (PXDN, FN1). Within the paracrine/autocrine factors, there were two proteins only detectable after MI: osteoprotegerin (OPG), which is known to enhance cardiomyocyte proliferation, and DnaJ heat shock protein family (Hsp40) member B11 (DNAJB11), whose function in cardiac remodeling is still unclear. ScRNA analyses revealed that the significantly higher secreted proteins were preferentially expressed by CF and were mostly enhanced post MI. In addition, an attempt was made to study the fibroblast-specific secretome of murine infarct-induced aCF in vivo by using AAV9-mediated biotinylation of POSTN+ CF-secreted proteins in the heart. To this end, an ER-localized biotin ligase (ER-TurboID), under control of an aCF specific promoter (AAV9-POSTN-ER-TurboID), was applied in vivo to enable measurements of the dynamic changes of the MI-induced aCF secretome in the coronary effluent of isolated perfused hearts. Analysis of POSTN+ CF secretome was limited by plasma proteins still present and low intensity distribution. However, some ECM-related and paracrine/autocrine factors were identified post MI that were also found to be significantly increased in the secretome of cultured CF after MI. In summary, CF in the infarcted heart specifically secrete a set of matrix proteins and several paracrine factors which can signal to surrounding cells and thus might be important in cardioprotection and fibrosis. Identified proteins may be therapeutic targets in the future to limit cardiac fibrosis. In addition, some of these proteins may be suitable as biomarkers to monitor the activation state of CF. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 24.04.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 24.04.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 08.01.2024 | |||||||
| Datum der Promotion: | 15.04.2024 |
