Dokument: Native-state characterization of the melanocortin system

Titel:	Native-state characterization of the melanocortin system
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65572
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20250506-083358-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Chu, Ci [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,75 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 22.04.2024 / geändert 22.04.2024
Beitragende:	Dr. Etzkorn, Manuel [Gutachter] Prof. Dr. Schröder, Gunnar [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind hochdynamisch und unterliegen konformationellen Umordnungen, die durch die Bindung extrazellulärer Reize hervorgerufen werden. Dadurch entstehen verschiedene Konformationen während der Aktivierung, die wiederum mit intrazellulären Signaltransduktoren interagieren und nachgeschaltete Signalwege initiieren. Die funktionellen und strukturellen Studien von GPCRs in vitro erfordern die Extraktion aus der zellulären Membran unter Verwendung von membranmimetischen Systemen. Eines der am weitesten verbreiteten Membranmimetika für GPCRs sind Detergenzien, welche ausgiebig für die strukturelle Charakterisierung von GPCRs verwendet wurde. Dabei kann das Detergens jedoch in den Transmembranhelix-Bündel eindringen und die GPCRs destabilisieren. Daher wurden alternative Methoden entwickelt. Die durch Membran-Scaffolding-Proteine (MSPs) gebildeten Lipiddoppelschicht-Nanodiscs wurden ebenfalls weit verbreitet eingesetzt und bieten eine stabilere Umgebung für funktionelle und strukturelle Studien von GPCRs. Die Extraktion von GPCRs erfordert jedoch weiterhin den Einsatz von Detergens, und der Prozess der Optimierung der Rekonstitution von GPCRs in MSP-Nanodiscs ist zeitaufwendig und arbeitsintensiv. Die funktionellen Aktivitäten von GPCRs, wie die Ligandenbindung und die GProtein-Kopplung, werden durch verschiedene Eigenschaften der umgebenden Phospholipiddoppelschicht reguliert, wie z. B. hydrophober Missmatch, Dicke der Doppelschicht, lateraler Druck, Membranfluidität, Krümmung und Zusammensetzung, die in Detergensmizellen oder synthetischen Phospholipiden fehlen oder schwer zu imitieren sind. Amphiphile Copolymere haben großes Interesse geweckt und bieten mehrere Vorteile, einschließlich der detergensfreien Extraktion und Reinigung von Membranproteinen zusammen mit ihren umgebenden nativen Phospholipiden aus der zellulären Membran, was zur Bildung von nativen Lipiddoppelschicht-Nanodiscs führt. Unter ihnen zeichnet sich das amphiphile Polymer Sulfo-DIBMA durch seine störungsfreie Charakterisierung von Protein-Protein- und Protein-LipidInteraktionen aus. Während die relativ geringe Extraktionseffizienz von Sulfo-DIBMA ihre Anwendung in NMRMessungen einschränken kann, die in der Regel eine große Menge an Proteinen erfordern. Der Melanocortin-4-Rezeptor (MC4R) spielt eine entscheidende Rolle bei der Regulation der Energiehomöostase und des Essverhalten. Es ist bekannt, dass physiologische Ionen die Funktion von MC4R stark beeinflussen, aber wenig ist darüber bekannt, wie die Regulation dieser Metallionen auf MC4R in verschiedenen Umgebungen erfolgt. Hierbei haben wir, um den Einfluss der Umgebung auf die funktionale Integrität von MC4R zu bewerten, MC4R, welcher in Sf9-Zellen exprimiert wurden, unter Verwendung verschiedener Membranmimetiksysteme, darunter Detergensmizellen, MSP-Nanodiscs und Sulfo-DIBMA-NativmembranNanodiscs, untersucht. Die Affinität von Ligandenbindung für MC4R wurde in verschiedenen Membranmimetika in Abwesenheit und Gegenwart von zweiwertigen Kationen untersucht. Unsere Daten zeigten, dass die funktionale Integrität von MC4R in der Lipiddoppelschicht gut erhalten ist, insbesondere in den Sulfo-DIBMA-NativmembranNanodiscs. Darüber hinaus spielt die Umgebung eine wichtige Rolle bei der allosterischen Modulation von MC4R. Angesichts der Vorteile von nativen Membran-Nanodiscs für in vitro funktionelle und strukturelle Studien von GPCRs ohne den Einsatz von Detergenzien oder künstlichen Lipiden sowie der Erhaltung der Lipiddoppelschichtarchitektur und -anordnung (z. B. Sulfo-DIBMA) haben wir eine Reihe neuer DIBMA-Varianten eingeführt und getestet. Wir stellten fest, dass mPEG4-DIBMA eine hohe Effizienz aufweist und nicht mit LigandLipid-Interaktionen interferiert, was uns mehr Möglichkeiten für die Untersuchung von GPCRs in einer nativen Lipiddoppelschichtumgebung unter Verwendung unterschiedlicher Technologien bietet. G-protein-coupled-receptors (GPCRs) are highly dynamic and undergo conformational rearrangements induced by the binding of extracellular stimuli, leading to different conformations during activation which in turn interact with intracellular signal transducers and initiate downstream signaling pathways. The functional and structural studies of GPCRs in vitro require the extraction from cellular membrane using membrane-mimiking systems. One of the most widely applied membrane mimetics for the solubilization and purification of GPCRs is detergent that has been extensively used for the structural characterization of GPCRs. However, detergents are also known to destabilize GPCRs. Therefore, alternative methods have been developed including lipid bilayer nanodiscs formed by membrane scaffold proteins (MSPs) which provide a more stable environment for the functional and structural studies of GPCRs. Still MSP nanodiscs require the extraction of GPCRs via detergents, and the process of optimizing the reconstitution of GPCRs into MSP nanodiscs is time-consuming and labor-intensive. The functional activities of GPCRs, such as ligand binding and G protein coupling, are regulated by different properties of surrounding phospholipid bilayer, such as hydrophobic mismatch, bilayer thickness, lateral pressure, membrane fluidity, curvature and composition, which are missing or difficult to mimic using detergent micelles or synthetic phospholipids. Of note, the amphiphilic copolymers have attracted great interest and offer several advantages, including the detergent-free extraction and purification of membrane proteins within their surrounding native phospholipids from cellular membrane, leading to the formation of native lipid-bilayer nanodiscs. Among them, the electronetural polymer Sulfo-DIBMA stands out for its interferencefree characterization of protein-protein and protein-lipid interactions. While the relatively low extraction efficiency of Sulfo-DIBMA may restrict its application in NMR measurements, which usually require a large amount of proteins. The melanocortin-4 receptor (MC4R) plays a critical role in the regulation of energy homeostasis and feeding behavior. It is known that the physiological ions strongly affect the function of MC4R, but little is known about the regulation of these metal ions on MC4R in different environments. Herein, in order to evaluate the influence of environment on the functional integrity of MC4R, we performed the solubilization and purification of MC4R expressed in Sf9 cells using different membrane mimicking systems, including detergent micelles, MSP nanodiscs and SulfoDIBMA native membrane nanodiscs. The ligand binding affinity for MC4R was examined in various membrane mimetics in the absence and presence of divalent cations. Our data demonstrated that the functional integrity of MC4R is well-preserved in lipid bilayer, especially in the Sulfo-DIBMA native membrane nanodiscs. Moreover, the environment plays an importment role in the allosteric modulation of MC4R. Given the advantages of native membrane nanodiscs for in vitro functional and structural studies of GPCRs without requiring detergents or artificial lipids, and the preservation of lipid-bilayer architecture and packing (e.g., Sulfo-DIBMA), we further introduced and tested a series of new DIBMA variants. We found that the new mPEG4- DIBMA variant exhibits high solubilization efficiency, and does not interfere with ligand-lipid interactions, providing us more choices for the studies of GPCRs in native lipid-bilayer environment using different technologies.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	06.05.2025
Dateien geändert am:	06.05.2025
Promotionsantrag am:	15.02.2024
Datum der Promotion:	15.03.2024