Dokument: Communities of Niche-optimized Strains (CoNoS) – a novel concept

Titel:	Communities of Niche-optimized Strains (CoNoS) – a novel concept
Weiterer Titel:	Communities of Niche-optimized Strains (CoNoS) – a novel concept for improving biotechnological production
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65355
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240409-114032-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Zuchowski, Rico [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 25,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.03.2024 / geändert 24.03.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Zurbriggen, Matias [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Globale Herausforderungen wie der Klimawandel und die Verknappung der natürlichen Ressourcen erfordern eine Transformation der auf der Nutzung fossiler Rohstoffe basierenden Wirtschaft hin zu einer modernen, nachhaltigen Bioökonomie. In diesem Zusammenhang ist die Etablierung hocheffizienter mikrobieller Produktionsprozesse auf der Grundlage erneuerbarer Kohlenstoffquellen von großer Bedeutung. In ihrer natürlichen Umgebung wachsen Bakterien in der Regel in komplexen Gemeinschaften und haben häufig Auxotrophien entwickelt, die durch cross-feeding-Interaktionen mit anderen Mitgliedern der Gemeinschaft ausgeglichen werden. Diese Arbeitsteilung kann zu einer effizienteren Nutzung der verfügbaren Ressourcen führen, weshalb sie eine potenzielle Strategie zur Steigerung der Effizienz mikrobieller Produktionsprozesse darstellt. In dieser Arbeit beschreiben wir das Design und den Aufbau von synthetischen, genomreduzierten mikrobiellen Gemeinschaften nach dem Konzept der Communities of Niche-optimized Strains (CoNoS), die aus einem Paar wechselseitig Aminosäure-auxotropher Stämme von Corynebacterium glutamicum, einer industriell wichtigen mikrobiellen Zellfabrik, bestehen. Ziel war es, die Produktionsmöglichkeiten solcher Gemeinschaften im Vergleich zu Monokulturen zu analysieren. Dies wurde exemplarisch für die L Arginin-Produktion mit einem CoNoS getestet, das aus einem L Leucin- und einem L Arginin-auxotrophen Stamm bestand. Zunächst wurden zehn Gemeinschaften mit verschiedenen Paaren von wechselseitig Aminosäure-auxotrophen Stämmen konstruiert. Die Stämme wurden zunächst auf rationale Weise genetisch so verändert, dass sie die vom Partnerstamm benötigte Aminosäure überproduzieren. Anschließend wurde die Gemeinschaft einer adaptiven Laborevolution (ALE) unterzogen, um ein schnelleres Wachstum zu erzielen. Dies führte zu stabilen Gemeinschaften mit Wachstumseigenschaften, die denen von Wildtyp-Monokulturen nahekommen. Die Genomanalyse der durch ALE erhaltenen Gemeinschaften ermöglichte die Identifizierung des ABC-Transporters ArgTUV als ersten und vermutlich einzigen L Arginin-Importer von C. glutamicum. Die Deletion der argTUV-Gene in einem L Arginin produzierenden Stamm verbesserte die L Arginin-Produktion in der Monokultur um 24 %. Dieses Ergebnis zeigt, dass der CoNoS-Ansatz ein wertvolles Konzept zur Identifizierung neuartiger Produktionsmerkmale ist, wobei vor allem Gene des Transports und Austausches von Metaboliten ein zentrales Ziel der Mutationen darstellen. Auch weitere Zielgene zur Verbesserung der Aminosäureproduktion wurden in anderen auxotrophen Stämmen identifiziert. Bei der Evolution einer Monokultur mit einem langsam wachsenden L Tryptophan-auxotrophen Stamm wurde eine Verbindung zwischen dem Protein TrpP und dem Expressionslevel des suf-Genclusters festgestellt, welches für den Aufbau und die Reparatur von Eisen-Schwefel-Clustern in Proteinen verantwortlich ist. Die Deletion von trpP verbesserte die L Tryptophan-Produktion, wobei die molekularen Grundlagen dieser Wirkung noch unbekannt sind. Bei einem CoNoS-Produktionsprozess scheint es für die Produktausbeute von Vorteil zu sein, das Wachstum eines Gemeinschaftsmitglieds zu begrenzen. Zu diesem Zweck wurden in unserem CoNoS, bestehend aus einem L Arginin- und einem L Leucin-auxotrophen Stamm, verschiedene metabolische Schalter auf ihre Fähigkeit zur Kontrolle der Gemeinschaft getestet. Dabei erwies sich ein Mechanismus, der auf der Repression des essentiellen pfkA-Gens im L Arginin auxotrophen Stamm unter Verwendung eines Gluconat-regulierbaren Expressionssystems beruht, als besonders vielversprechend. Mit diesem CoNoS konnte der L Arginin-Titer in einer Fermentation gegenüber einer prototrophen Monokultur mit identischen Mutationen für eine verbesserte L Arginin-Synthese um mehr als 70 % gesteigert werden. Dieser Anstieg war vermutlich auf die Kohlenstoff- und Energieeinsparungen durch die Auxotrophie zurückzuführen, da eine mit L Leucin supplementierte L Leucin-auxotrophe Monokultur ebenfalls einen mehr als zwei Mal so hohen L Arginin-Titer als die prototrophe Monokultur erreichte. Insgesamt hat sich das CoNoS-Konzept als wertvolles Instrument zur Identifizierung neuartiger Produktionsmerkmale erwiesen, und könnte in Zukunft auch für die Entwicklung neuer Co-Kultur-basierter Produktionsverfahren genutzt werden, die zu einer nachhaltigen Bioökonomie beitragen. Global challenges such as climate change and resource depletion require a transformation of the fossil-based economy toward a modern, sustainable bioeconomy. In this context, the establishment of efficient microbial production processes based on renewable carbon sources is of major importance. In natural environments, bacteria usually grow in complex communities and often evolve auxotrophies, which are relieved by cross-feeding interactions with other community members. This division of labor can lead to a more efficient use of the available resources, because of which it was proposed to be a viable strategy for increasing the efficiency of microbial production processes. In this thesis, we describe the design and setup of synthetic, genome-reduced microbial communities according to the concept of Communities of Niche-optimized Strains (CoNoS), which are comprised of a pair of mutually dependent amino acid-auxotrophic strains of Corynebacterium glutamicum, an industrially important microbial cell factory. The aim was to analyze the production capabilities of such communities in comparison with those of monocultures. This was exemplarily tested with respect to L-arginine production with a CoNoS composed of an L leucine- and an L arginine-auxotrophic strain. We initially started from ten communities with different pairs of mutual amino acid auxotrophic strains. The auxotrophic strains were rationally engineered to overproduce the amino acid required by the partner strain, and then the community was subjected to adaptive laboratory evolution (ALE) to improve growth. This resulted in stable communities with growth properties close to wild type monocultures. Genome analysis of the communities obtained by ALE enabled the identification of the ABC transporter ArgTUV as the first and presumably only L arginine importer of C. glutamicum. Deletion of the argTUV genes in an L arginine production strain improved L arginine production in the monoculture by 24 %. This result demonstrated that the CoNoS approach is a valuable concept for identifying novel production traits, with metabolite transport and exchange being a major target. Also, further target genes improving amino acid overproduction were identified in other auxotrophic strains. Evolution of a monoculture with a poorly performing L tryptophan-auxotrophic strain revealed a link between a protein named TrpP and the expression level of the suf gene cluster, which is responsible for assembly and repair of iron-sulfur clusters in proteins. It turned out that the deletion of trpP improved L tryptophan production, but the molecular basis of this effect is still unclear. For a CoNoS production process, it seems beneficial for product yield to limit growth of the community member that does not produce the desired final product. For this purpose, different metabolic switches were tested regarding their capability of community control in our CoNoS consisting of an L arginine and an L leucine auxotrophic strain. Here, a mechanism based on repression of the essential pfkA gene in the L arginine auxotrophic strain using a gluconate-regulatable expression system was most promising. The L arginine titer of a bioprocess with this CoNoS outcompeted a fermentation based on a prototrophic monoculture with identical mutations for improved L arginine synthesis by more than 70 %. This increase was presumably due to carbon and energy savings from the auxotrophy, as an L leucine-auxotrophic monoculture supplemented with L leucine also produced more than 2-fold higher L arginine titers than the prototrophic monoculture. In summary, CoNoS turned out to be a valuable tool to identify novel production traits and might also be used in the future to develop new co-culture production processes contributing to a sustainable bioeconomy.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	09.04.2024
Dateien geändert am:	09.04.2024
Promotionsantrag am:	30.05.2023
Datum der Promotion:	15.11.2023