Dokument: Aufklärung molekularer Pathomechanismen des WT1-assoziierten nephrotischen Syndroms

Titel:	Aufklärung molekularer Pathomechanismen des WT1-assoziierten nephrotischen Syndroms
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6528
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20080107-105704-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Jeruschke, Stefanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,60 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 12.12.2007 / geändert 12.12.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Royer-Pokora, Brigitte [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die genetische Ursache des Denys-Drash Syndroms (DDS) sind Missensemutationen in der Zinkfingerregion des WT1-Gens, das für einen Transkriptionsfaktor kodiert, der während der Nephrogenese und bei der normalen Podozytenfunktion eine wichtige Rolle spielt. Das Denys-Drash Syndrom ist eine Kombination aus Urogenitalfehlbildungen, nephrotischem Syndrom, das meist vor dem 2. Lebensjahr zum terminalen Nierenversagen führt, und Wilms’-Tumor. Histologisch manifestiert es sich als diffuse mesangiale Sklerose und führt zu einem Funktionsverlust der Filtrationsbarriere. Ziel der vorliegenden Dissertation war es, Mechanismen, die aufgrund einer heterozygot vorliegenden WT1-Mutation zur Entstehung der diffusen mesangialen Sklerose beim Denys-Drash Syndrom führen, mit Hilfe verschiedener molekulargenetischer und biochemischer Analysen zu untersuchen. Um zu bestätigen, dass WT1 Missense-Mutationen beim Menschen die terminale glomeruläre Reifung stören, wurden Glomeruli von DDS-Patienten mit fötalen Stadien sowie mit Glomeruli eines Kindes und von Erwachsenen verglichen. Es konnte eine Entwicklungs-Verzögerung in den DDS-Patienten festgestellt werden: 1) Die DDS-Podozyten exprimieren reduzierte Mengen an WT1 mRNA, und das Verhältnis der vier alternativ gespleißten WT1 mRNA Isoformen entspricht den fötalen „capillary-loop“ Stadien. 2) Die DDS-Podozyten exprimieren ein Verhältnis der angiogenetischen Isoform VEGF165a zur inhibitorischen Isoform VEGF165b, das dem fötalen „s-shape“ Stadium entspricht. 3) Den DDS-Glomeruli fehlt Collagen IV alpha 4 und Laminin beta 2, zwei Komponenten der reifen glomerulären Basalmembran (GBM). Die reduzierten WT1 mRNA-Mengen in den DDS-Podozyten und die dominant-negative Art und Weise, in der die heterozygoten Missense-Mutationen wahrscheinlich agieren, resultieren in einer Abnahme von wildtypischem WT1 in den Podozyten. Dieses hat wahrscheinlich wichtige Effekte auf die Expressionslevel von WT1-Zielgenen. Um herauszufinden, welche Gene in DDS-Podozyten fehlreguliert sind, wurden von primären Podozyten-Zellkulturen Expressionsprofile erstellt und mit denen von Kontrollen (kindliche und adulte Podozyten; Podozyten eines Patienten mit kongenitalem nephrotischen Syndrom vom finnischen Typ (CNF) mit NPHS1-Mutation) verglichen. Alle Kulturen exprimierten dabei die spezifischen Podozytenmarker WT1, Podocin, Nephrin, CD2AP, Synaptopodin, Densin, POD1 und Vimentin. Da die Hauptzahl der differentiell exprimierten Gene bei beiden nephrotischen Erkrankungen (DDS und CNF) fehlreguliert waren, kann vermutet werden, dass die Podozyten-Schädigung selber, unabhängig von der primären Ursache, eine Kaskade von sekundären Prozessen startet. Die Gene, die nur aufgrund der WT1- oder NPHS1-Mutation fehlreguliert sind, repräsentieren wahrscheinlich den primären Effekt der jeweiligen Mutation. Die differentiell exprimierten Gene aus den Arrayanalysen wurden aufgrund ihrer Funktion folgenden Gruppen zugeteilt: 1) Zelladhäsion und Cytoskelett (ITGA6, COL4A1, COL4A2, COL4A5, ICAM1, VCAM1), 2) Angiogenese (VEGFA, HIF1alpha, IGFBP3, MMP1, MMP2, MMP14, TIMP3, TGFbeta1), 3) Produktion von extrazellulärer Matrix (IGFBP3, IGFBP5, TNFA, ET2, MMP1, MMP2, MMP7), 4) Nierenentwicklung (PAX2, SOX9, EMX2, Gremlin). Eine Fehlregulation dieser Proteine könnte zu einer unvollständigen Reifung und nicht abgeschlossenen Differenzierung der Podozyten, einer gestörten Verankerung der Podozyten mit der GBM und zu Ablagerung von extrazellulärer Matrix führen, was letztendlich eine Proteinurie und Glomerulosklerose zur Folge haben könnte. Da die primären DDS-Podozyten-Zellkulturen von Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz stammten, entsprechen die Expressionsprofile wahrscheinlich einem fortgeschrittenen Stadium der Krankheit. Um früheste Änderungen zu analysieren, die durch einen Verlust von WT1 in den Podozyten zustande kommen, wurde WT1 in immortalisierten nicht erkrankten Podozyten und embryonalen Nierenzellen mit einer spezifischen WT1-siRNA herunterreguliert. Um die Effekte eines WT1 Knock-downs zu untersuchen, wurden Expressionsanalysen mittels Arrays durchgeführt. Neben schon bekannten WT1-Zielgenen (EGFR, EGR1 und INHA) konnten auch neue putative Zielgene (Gremlin und MMP1) identifiziert werden, die eine Rolle während der Nierenentwicklung spielen könnten. Zusammenfassend lässt sich festhalten, dass, obwohl es sich beim Denys-Drash Syndrom um eine monogene Erkrankung handelt, mutiertes WT1 direkt oder indirekt in verschiedene Prozesse der Zelle eingreift (Zelladhäsion, Cytoskelett, Angiogenese, ECM-Produktion). Eine der frühesten Veränderungen ist sicherlich eine Entwicklungsverzögerung in den Podozyten, die sich wiederum auf benachbarte Zellen aber auch auf die Homöostase der Podozyten auswirkt und letztlich eine Glomerulosklerose verursacht. The purpose of the present thesis was to gain new insights into how heterozygous WT1 mutations ultimately lead to diffuse mesangial sclerosis in patients with Denys-Drash syndrome. Therefore different molecular genetic and biochemical analyses were used. To test if WT1 missense mutations in humans interfere with terminal glomerular maturation, glomeruli of DDS patients were compared to fetal stages and to glomeruli of a child and adults. A developmental delay could be demonstrated in DDS patients: 1) DDS-podocytes express reduced levels of WT1 mRNA, and the ratio of the four alternatively spliced WT1 mRNA isoforms resembles that of fetal capillary-loop stages. 2) DDS-podocytes express a ratio of angiogenetic isoform VEGF165a to inhibitory isoform VEGF165b that resembles fetal s-shape stages. 3) DDS-glomeruli lack collagen IV alpha 4 and laminin beta 2, two components of the mature GBM. The reduced level of WT1 mRNAs in DDS-podocytes and the dominant negative manner in which heterozygous missense mutations are expected to act results in a decrease of wildtyp WT1 in podocytes. This in turn is expected to have important effects on the expression level of WT1 target genes. To find out which genes are deregulated in DDS-podocytes, expression profiles were generated from primary podocyte cell cultures and compared to those of controls (podocytes of children and adults; podocytes of a patient with congenital nephrotic syndrome of the Finnish type (CNF) due to a NPHS1 mutation). All cell cultures expressed specific podocyte markers like WT1, Podocin, Nephrin, CD2AP, Synaptopodin, Densin POD1 and Vimentin. The finding that most of the genes are deregulated in both nephrotic syndrome diseases (DDS and CNF) suggests that podocyte injury itself, independent of its primary cause, may start automatically a cascade of secondary processes. In contrast, genes only deregulated in WT1-mutated or NPHS1-mutated podocytes may represent a primary effect of the underlying mutation. Due to their function differential expressed genes were assigned to the following groups: 1) cell adhesion and cytoskeleton (ITGA6, COL4A1, COL4A2, COL4A5, ICAM1, VCAM1), 2) angiogenesis (VEGFA, HIF1alpha, IGFBP3, MMP1, MMP2, MMP14, TIMP3, TGFbeta1), 3) production of extracellular matrix (IGFBP3, IGFBP5, TNFA, ET2, MMP1, MMP2, MMP7), 4) nephrogenesis (PAX2, SOX9, EMX2, Gremlin). A deregulation of these proteins may lead to an incomplete maturation of podocytes, a disturbed anchorage of podocytes within the GBM and to an expansion of extracellular matrix. This could lead at last to proteinuria and glomerulosclerosis. Due to the fact that the primary DDS podocyte cell cultures were established from patients with end-stage renal failure, the expression profiles probably correspond to an advanced stage of disease. To analyze the earliest changes caused by a dramatic decrease of WT1 in podocytes, the RNAi technology was used to knockdown WT1 in normal immortalyzed podocytes and embryonic kidney cells with a specific WT1-siRNA. This technology was combined with array analyses to identify putative WT1 target genes. Beside already known WT1 target genes (EGFR, EGR1 und INHA) new putative target genes (Gremlin und MMP1) which play a role during nephrogenesis were identified. Although Denys-Drash syndrome is a monogenetic disease, mutant WT1 interferes directly or indirectly with a variety of cellular processes (cell adhesion, cytoskeleton, angiogenesis, production of extracellular matrix). One of the earliest changes is certainly a delay in podocyte maturation which in turn affects neighbouring cells as well as the homeostasis of podocytes and ultimately leads to glomerulosclerosis.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	12.12.2007
Dateien geändert am:	12.12.2007
Promotionsantrag am:	20.08.2007
Datum der Promotion:	11.12.2007