Dokument: Host-derived endosymbiont-targeted proteins form part of the division machinery of the bacterial endosymbiont in the trypanosomatid Angomonas deanei

Titel:	Host-derived endosymbiont-targeted proteins form part of the division machinery of the bacterial endosymbiont in the trypanosomatid Angomonas deanei
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65279
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240328-111124-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ehret, Georg [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,03 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 19.03.2024 / geändert 19.03.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Nowack, Eva C. M. [Gutachter] Prof. Dr. Johannes Hegemann [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Da das Leben aller Zellen endlich ist, ist die kostenintensive Zellteilung für das Überleben unerlässlich. Meistens ist die Verfügbarkeit von Nährstoffen und Lebensräumen begrenzt, und ein inter- oder intraspezifischer Wettbewerb ist unvermeidlich. In einigen Fällen haben sich in diesem Wettlauf aller Organismen um die Ressourcen eng verbundene Konsortien von Organismen verschiedener Arten entwickelt. Diese artenübergreifenden mikrobiellen Gemeinschaften können nach ihren Auswirkungen auf die Interaktionspartner klassifiziert werden. Wenn eine oder mehrere Parteien davon profitieren, spricht man von einer Symbiose. Wird hingegen eine Partei zum Nutzen einer anderen geschädigt, spricht man von Parasitismus. Je länger ein Konsortium von Organismen im selben Biotop lebt, desto mehr Anpassungen treten auf und verfeinern langsam ihre Fähigkeiten während des evolutionären Wettrüstens. Die Entwicklung einer Interaktion, vor allem in der Anfangsphase, kann es Neuankömmlingen ermöglichen, wachstumsbegrenzende Faktoren zu erhalten. Es ist viel einfacher, eine begrenzte Ressource von einem anderen Organismus zu erbeuten, als einen kompletten Weg für die De-novo-Synthese zu entwickeln, was zu einer Abhängigkeit führt, die für das Überleben unerlässlich werden kann. Oft ist dies mit räuberischem Verhalten verbunden, entweder durch Phagozytose-ähnliche Prozesse oder durch Invasion eines Organismus in einen anderen, wenn es sich um einzellige Organismen handelt, und den Tod des angegriffenen Organismus häufig bedeutet. In einigen Fällen scheinen das Verbleiben und Überleben eines Organismus im Inneren eines anderen für beide Seiten jedoch von Vorteil zu sein. Dieser Prozess wird als Endosymbiose bezeichnet und ist vermutlich ein Schlüsselelement in der Evolution der Eukaryonten, definiert durch die Aufnahme von Mitochondrien und Chloroplasten vor mehr als einer Milliarde Jahren. Das Interesse an der Erforschung der frühen Schritte der Endosymbiose führte zur Suche nach Organismen, bei denen in jüngerer Zeit eine Symbionten Inkorporation stattgefunden hat. Zwei Fälle von einzelligen Organismen, die bakterielle Endosymbionten (ES) beherbergen, standen in unserem Institut im Mittelpunkt des Interesses: zum einen Paulinella chromatophora mit seinem photosynthetisch aktiven ES von −cyanobakteriellem Ursprung und zum anderen Angomonas deanei - ein begeißelter Trypanosomatid mit einem −proteobakteriellen ES. Die genetische Modifizierbarkeit machte A. deanei zu einem perfekten Kandidaten als Modellorganismus für eine sehr junge, aber stabile endosymbiotische Beziehung unbekannten Ursprungs. Da Candidatus Kinetoplastibacterium crithidii, der bakterielle ES, aus einer Linie von hauptsächlich intrazellulären Krankheitserregern stammt und bei Trypanosomatida bisher nicht beobachtet wurde, dass sie Bakterien aufnehmen, III könnte der ES ursprünglich als Krankheitserreger in den Wirt gelangt sein. Eine Zusammenfassung massenspektrometrische Analyse des gesamten Proteoms wurde durchgeführt, um das Ausmaß der Kontrolle zu verstehen, die der Wirt über die ES ausübt, und ergab nur sehr wenige mutmaßliche vom Wirt kodierte und zum ES transportierte potenzielle Effektorproteine, die für die Kontrolle der ES erforderlich sind. Die experimentelle Überprüfung dieser vom Wirt kodierten Proteine ergab, dass nur 7 dieser so genannten “Endosymbiont targeted Proteins (ETPs) an oder in dem ES zu finden sind. Drei Proteine, ETP2, ETP7 und ETP9, scheinen sich an der Teilungsstelle des ES zu befinden, und im Rahmen dieser Arbeit wurden insbesondere ETP2 und ETP7 näher untersucht. Es wurden mehrere Versuche unternommen, homozygote Deletionen beider Gene in A. deanei zu erzeugen sowie ein Allel gegen einen Resistenzmarker auszutauschen und Reporter-Fusionsprotein-Konstrukte in die endogenen Loci einzufügen, um die Funktionsfähigkeit der Fusionskonstrukte zu testen. Zur Funktionanalyse der Gene in vivo, wurden in A. deanei ein konditionelles Proteinstabilisierungssystem sowie ein konditionelles System zum Ausschneiden des Gens und ein induzierbares Expressionssystem eingesetzt. Knock-outs von ETP2, ETP7 und ETP9 wurden auch im aposymbiotischen Stamm ATCC-30969 von A. deanei getestet. In-silico-Analysen von ETP2 und ETP7 ergaben, dass beide nur bei den Strigomonadinae vorkommen, aber selbst innerhalb dieser kleinen Gruppe sind beide Proteine nur wenig konserviert, und für ETP2 konnte keine Funktion vorhergesagt werden. Für ETP7 wurde jedoch gemäß der Phyre²-Modellierung eine mutmaßliche Peptidoglykan (PG)-Hydrolase-Domäne vorhergesagt. Darüber hinaus wurde die Identifizierung von Interaktionspartnern mittels Co-Immunopräzipitation getestet, um mögliche Hinweise auf die Wirkungsweise von ETP2 und ETP7 in dem ES zu erhalten. Um die PG-hydrolysierende Aktivität zu testen, wurde ETP7 in E. coli und Leishmania tarentolae exprimiert und für den In-Gel-Peptidoglykan-Hydrolyse-Assay (Zymogramm) sowie durch Trübungsabbau und Farbstofffreisetzung in Plattenlese-Assays aufgereinigt. Darüber hinaus wurde die Fähigkeit von ETP7 zur Bindung an −Lactame, wie sie bei Penicillin-bindenden Proteinen (PBPs) beobachtet wird, untersucht. Da alle Schritte der PG-Umstrukturierung im Intermembranraum des Bakteriums stattfinden, muss ETP7 in der Lage sein, durch die äußere Membran des ES zu wandern. Um dies zu überprüfen, wurde Immunogold-Transmissions-Elektronenmikroskopie an A. deanei eingesetzt, um die subzelluläre Lokalisierung zu bestimmen. As life of all cells is finite, cost-intense cellular division is essential for survival. Most often availability of nutrients and habitats is limiting and inter– or intraspecific competition is unavoidable. In some cases tightly associated consortia of organisms of different species have developed in this race for resources by all organisms. These multi-species microbial communities can be classified by its effect on the interactors. If one or several parties’ benefit, it is called symbiosis. On the other hand, if one party is damaged for the benefit or another, it is called parasitism. The longer a consortia of organisms is found in the same biome, the more adaptions occur, slowly refining their abilities during the evolutionary arms race. The evolution of an interaction, especially in its early steps may allow newcomers to obtain growth limiting factors. It is much easier to scavenge a limited resource from another organism than to evolve an entire pathway for de novo synthesis, leading to a dependence, which can become obligate for survival. Often, this is linked to predatory behavior, either by phagocytosis-like processes or by invasion of one organism into another in the cases of single cell organisms and death of the exploited organism is very common. In some cases the retainment and survival of one organism inside another instead seems to be beneficial for both parties. This process has been termed endosymbiosis and is believed to be a key element in the evolution of eukaryotes through the acquisition of mitochondria and chloroplasts more than one billion years ago. Interest in the research of the early steps of endosymbiosis lead to a search for organisms featuring more recent cases of symbiont incorporation. Two cases of unicellular organisms harboring bacterial endosymbionts (ES) have been the center of attention in our institute: on the one hand Paulinella chromatophora with its photosynthetically active ES of −cyanobacterial origin and on the other hand Angomonas deanei – a flagellated trypanosomatid with a −proteobacterial ES. Genetic tractability made A. deanei a perfect candidate as a model organism for a very young but stable endosymbiotic relationship of unknown origin. As Candidatus Kinetoplastibacterium crithidii, the bacterial ES originates from a lineage of mainly intracellular pathogens and trypanosomatida have not been observed yet to engulf bacteria, the ES may initially have entered the host as pathogen. Mass spectrometric analysis by whole proteome comparison was performed to understand the level of control, that the host has established over the ES, and revealed only very few putative host-encoded and ES-targeted proteins, which are potential effector proteins necessary for controlling the ES. Experimental verification of these host-encoded proteins showed that only 7, of these so called endosymbiont targeted proteins (ETPs) can be found at or in the ES. Three proteins, ETP2, ETP7, and ETP9 seem to be located at the site of division of the ES and during this thesis I particularly ETP2 and ETP7 were explored in more detail. Several attempts were made to generate Summary homozygous knockouts of both genes in A. deanei as well as substitution of one allele against a resistance marker and insertion of reporter fusion protein constructs into the endogenous loci, to test viability of fusion constructs. To explore the function of the genes in-vivo a conditional protein stabilization system as well as a conditional gene excision system and an inducible expression system were deployed in A. deanei. Knock-outs of ETP2, ETP7 and ETP9 were also tested in the aposymbiotic strain ATCC-30969 of A. deanei. In-silico analyses of ETP2 and ETP7 identified both to be unique to the Strigomonadinae, but even within this small group both proteins are poorly conserved and no predicted function for ETP2 could be identified. ETP7 however was predicted to contain a putative peptidoglycan (PG) hydrolase domain according to Phyre² modelling. Furthermore, identification of interaction partners via Co immunoprecipitation was tested to find hinds on the mode of action of ETP2 and ETP7 in the ES. To test PG-hydrolyzing activity, ETP7 was expressed in E. coli and Leishmania tarentolae and purified for in-gel peptidoglycan hydrolysis assay (zymogram) and via turbidity clearing and dye release in plate reader assays. Furthermore, the ability of ETP7 to bind to -lactams, as observed in penicillin binding proteins (PBPs), was explored. As all steps involving PG restructuring happen in the intermembrane space of the bacterium, ETP7 must be able to migrate through the outer membrane of the ES. To verify this, immunogold-transmission electron microscopy of A. deanei was established, to determine the subcellular localization.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	28.03.2024
Dateien geändert am:	28.03.2024
Promotionsantrag am:	08.08.2023
Datum der Promotion:	01.02.2024