Dokument: Studies on the cAMP-responsive regulatory network of Corynebacterium glutamicum
| Titel: | Studies on the cAMP-responsive regulatory network of Corynebacterium glutamicum | |||||||
| Weiterer Titel: | Studien über das cAMP-abhängige regulatorische Netzwerk von Corynebacterium glutamicum | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65259 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240320-073518-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Wolf, Natalie [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Georg Groth [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | cAMP Corynebacterium glutamicum | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist eines der am besten untersuchten Signalmoleküle. In Prokaryonten ist das Molekül an zahlreichen Prozessen beteiligt, z. B. am Stoffwechsel, an der Motilität und an der Virulenz. Im Gram-positiven Actinobakterium Corynebacterium glutamicum dient cAMP als Effektor für den globalen Transkriptionsregulator GlxR, ein Homolog von Crp aus Escherichia coli. Die für Synthese und Abbau von cAMP verantwortlichen Enzyme sind in C. glutamicum die membrangebundene Adenylatzyklase CyaB bzw. die zytoplasmatische Phosphodiesterase CpdA. In dieser Studie wurden die Folgen eines verminderten intrazellulären cAMP-Spiegels einer cyaB-Deletionsmutante (ΔcyaB) untersucht. Hauptziele waren (i) die Charakterisierung der physiologischen Unterschiede zwischen der ΔcyaB-Mutante und dem Wildtyp-Stamm und (ii) die Untersuchung der Auswirkungen eines niedrigen cAMP-Spiegels auf GlxR-DNA Interaktionen
in vivo. Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: (i) Das Fehlen von CyaB führte zu einem Wachstumsdefekt in Gegenwart von Acetat, der durch plasmidbasierte cyaB-Expression oder Supplementierung des Mediums mit cAMP aufgehoben werden konnte. Der Acetat-Effekt war konzentrations- und pH-abhängig, was auf einen Zusammenhang mit der Entkoppleraktivität von Acetat hindeutete. In Übereinstimmung damit besaß die ΔcyaB-Mutante eine erhöhte Sensitivität gegenüber dem Protonophor Carbonylcyanid-m-Chlorphenylhydrazon (CCCP) sowie bei Wachstum in Gegenwart von Acetat ein niedrigeres Membranpotential als der Wildtyp. Transkriptom- und RT-qPCR-Analysen zeigten, dass die Expression der durch GlxR aktivierten Gene für den Cytochrom-bc1-aa3-Superkomplex in der ΔcyaB Mutante verringert war. Da der Superkomplex der Hauptlieferant der protonen-motorischen Kraft in C. glutamicum ist, wurde eine verringerte Expression seiner Gene als Hauptursache für die Acetat und Entkoppler-Sensitivität der ΔcyaB-Mutante postuliert. Bei der Kultivierung der ΔcyaB-Mutante mit Acetat wurde eine Suppressor-Mutante identifiziert, die die Acetat-Empfindlichkeit verloren hatte. Die Genomsequenzanalyse ergab eine einzige Mutation in dem Suppressorstamm, die den Aminosäureaustausch Ala131Thr in GlxR verursachte. Durch Einführung dieser Punktmutation in das Genom der parentalen ΔcyaB-Mutante wurde der Wachstumsdefekt auf Acetat wiederhergestellt, was die Bedeutung von GlxR für den Phänotyp der ΔcyaB-Mutante und die Kontrolle des Energiestoffwechsels belegt. (ii) Der Einfluss eines verringerten cAMP-Spiegels auf die GlxR-DNA-Interaktion in vivo wurde durch ChAP-Seq-Experimente mit dem Wildtyp und der ΔcyaB-Mutante untersucht, die entweder auf Glukose oder auf Glukose plus Acetat kultiviert wurden. Die Analyse der vier Datensätze ergab 243 GlxR-Peaks mit einem Anreicherungsfaktor (AF) von ≥3 in mindestens einem Datensatz. Die de novo Motivsuche identifizierte die Konsensussequenz TGTGN8CACA in 242 der GlxR-Peaks. 141 dieser Peaks wurden auch in früheren Studien gefunden, während 102 Peaks neue Bindungsstellen repräsentieren. Bemerkenswert ist, dass die meisten der 243 GlxR-Bindungsstellen in allen vier Datensätzen angereichert waren, wenn ein AF ≥1,5 als Grenzwert verwendet wurde. Die Ergebnisse zeigen, dass der stark verringerte oder völlig fehlende cAMP-Spiegel in der ΔcyaB-Mutante die GlxR Bindung, insbesondere in Gegenwart von Acetat, reduzierte, aber nicht verhinderte. Dies deutet darauf hin, dass die GlxR-Bindung in vivo weniger cAMP-abhängig ist als die GlxR-Bindung in vitro und dass zusätzliche, noch unbekannte Faktoren an der Kontrolle der GlxR-Bindung an die DNA innerhalb der Zelle beteiligt sein könnten.Cyclic adenosine monophosphate (cAMP) is one of the best studied signalling molecules. In prokaryotes, the molecule was shown to be involved in numerous processes, such as metabolism, motility, and virulence. In the Gram-positive actinobacterium Corynebacterium glutamicum, cAMP serves as an effector for the global transcriptional regulator GlxR, a homolog of Crp of Escherichia coli. Enzymes responsible for the synthesis and degradation of cAMP in C. glutamicum are the membrane-bound adenylate cyclase CyaB and the cytoplasmic phosphodiesterase CpdA, respectively. In this study, the consequences of decreased intracellular cAMP levels of a cyaB deletion mutant (ΔcyaB) were investigated. The main objectives were (i) to characterize the physiological differences between the ΔcyaB mutant and the wild-type strain and (ii) to investigate the effects of a low cAMP level on GlxR-DNA interactions in vivo. The following results were obtained: (i) The lack of the adenylate cyclase CyaB led to a growth defect of C. glutamicum when acetate was present in the medium. The acetate sensitivity of the ΔcyaB mutant could be reversed by plasmid based cyaB expression or supplementation of the medium with cAMP, showing that indeed the low intracellular cAMP level in the ΔcyaB mutant was the reason for this acetate sensitivity. The acetate effect was concentration- and pH-dependent, suggesting a link to the uncoupling activity of acetate. In agreement, the ΔcyaB mutant displayed an increased sensitivity to the protonophore carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone (CCCP). The increased uncoupler sensitivity correlated with a lowered membrane potential of acetate-grown ΔcyaB cells compared to wild-type cells. Transcriptome analyses and RT-qPCR experiments showed that the genes encoding the cytochrome bc1-aa3 supercomplex and the F1FO-ATP synthase, previously shown to be activated by GlxR, had a decreased expression in the ΔcyaB mutant. Since the cytochrome bc1-aa3 supercomplex is the major provider of proton-motive force in C. glutamicum, decreased expression of its genes in the ΔcyaB mutant was assumed to be mainly responsible for the deficits in energy metabolism and the higher sensitivity to uncouplers. During cultivations of ΔcyaB mutant with acetate, a suppressor mutant was identified which had lost the acetate sensitivity. Genome sequence analysis revealed a single mutation in the suppressor strain causing the amino acid exchange Ala131Thr in GlxR. Introduction of this point mutation into the original ΔcyaB mutant abolished the growth defect on acetate, supporting the importance of GlxR for the phenotype of the ΔcyaB mutant and for the control of energy metabolism. (ii) The influence of a lowered cAMP level on GlxR-DNA interaction in vivo was studied by ChAP-Seq experiments with the wild type and ΔcyaB mutant grown either on glucose or on glucose plus acetate. Analysis of the four data sets identified 243 GlxR peaks with an enrichment factor (EF) of ≥3 in at least one data set. De novo motif search identified the consensus sequence TGTGN8CACA in 242 of the GlxR peaks. 141 of these peaks were also reported in previous studies, whereas 102 represent novel binding sites. Remarkably, the majority of the 243 GlxR binding sites were found to be enriched in all four data sets when using an EF ≥1.5 as cutoff. These results show that the strongly diminished or completely absent cAMP level in the ΔcyaB mutant reduced GlxR binding, particularly in the presence of acetate, but did not prevent it. This suggests that GlxR binding to its target sites in vivo is less dependent on cAMP than GlxR binding in vitro and that additional, yet unknown factors might be involved in the control of GlxR-binding to DNA within the cell. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.03.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 20.03.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 03.05.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 11.08.2023 |
