Dokument: Struktur und Funktion von Transaminasen aus Corynebacterium glutamicum
| Titel: | Struktur und Funktion von Transaminasen aus Corynebacterium glutamicum | |||||||
| Weiterer Titel: | Structure and function of transaminases of Corynebacterium glutamicum | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6525 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20071214-104100-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dipl.-Biol. Marienhagen, Jan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Sahm, Hermann [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Transaminasen, Aminotransferasen, Corynebacterium glutamicum, Biotechnologie, Aminosäuren | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | In den Synthesewegen der meisten Aminosäuren katalysieren Transaminasen
reversibel den Transfer einer Aminogruppe von einer α-Aminosäure zu einer α-Ketosäure. Diese Enzyme sind untereinander durch hohe Sequenzhomologien, eine sehr ähnliche Struktur und überlappende Substratspezifitäten gekennzeichnet. Ziel der Arbeit war es, detaillierte Kenntnisse zur Funktion und Struktur der Transaminasen in Corynebacterium glutamicum mit besonderem Augenmerk auf die an der verzweigtkettigen Aminosäuresynthese beteiligten Enzyme, zu erarbeiten. Insgesamt wurden zwanzig Proteine mit Transaminasemotiv isoliert und in vitro bezüglich ihres Substratspektrums charakterisiert. Zusätzlich wurde die in vivo Funktion durch chromosomale Deletionen untersucht. Auf diese Weise gelang es unter anderem, die L-Alanin-Transaminase AlaT und die für die Lysinbildung wichtige Aspartat-Transaminase AspC zu identifizieren. Darüber hinaus konnte zwei Proteinen eine Funktion als Cystein-Desulfurasen zugeordnet werden, die an der Synthese von FeS-Clustern beteiligt sind. Es konnte ferner gezeigt werden, dass die Transaminase für die verzweigtkettigen Aminosäuren IlvE in vitro mit vergleichbarer spezifischer Aktivität von 9,6 - 13,9 μmol min-1 mg (Protein)-1 die L-Leucin, L-Isoleucin- und L-Valin-Bildung katalysiert. In vivo ist das Enzym aber nur für die L-Isoleucin- und L-Leucin-Synthese essentiell. Als weitere Transaminase für die Synthese der verzweigtkettigen Aminosäuren konnte die Alanin- Valin Transaminase AvtA identifiziert werden. Das Enzym verwendet ausschließlich L-Alanin als Aminodonor und katalysiert mit einer hohen spezifischen Aktivität von 18,2 μmol min-1 mg (Protein)-1 die Bildung von L-Valin. Diese Aktivität ermöglicht in ilvE-Deletionsmutanten die L-Valinsynthese. Die Transaminase AroT katalysiert die Bildung von L-Phenylalanin und L-Tyrosin. Interessanterweise setzt AroT mit weniger als 10 % der spezifischen Aktivität gegenüber Phenylpyruvat auch 2-Keto-isocapronsäure zu L-Leucin um, nicht aber die Vorstufen von L-Isoleucin oder L-Valin. Durch gerichtete Enzymevolution gelang es, ein AroT-Mutein mit der Mutation M54L zu isolieren, welches 2-Keto-isocapronsäure mit nahezu verdoppelter katalytischer Effizienz von 59 M-1 s-1 umsetzt. Die L-Histidinol-phosphat-Transaminase HisC wurde kristallisiert, und es wurde ein Strukturmodell bei einer maximalen Auflösung von 1,8 Å bestimmt. Dieses Modell umfasste 364 von 366 Aminosäuren und gab in Verbindung mit Mutationen im aktiven Zentrum Aufschluss über die an der Katalyse beteiligten Aminosäurereste. Während die meisten Mutationen zu einer verminderten Aktivität führten, verdoppelte sich die spezifische Aktivität für die L-Tyrosinbildung von 0,5 auf 0,9 μmol min-1 mg (Protein)-1 wenn Tyr123 durch Phe ersetzt wurde. Bei der biotechnologischen Produktion von L-Valin mit C. glutamicum wird L-Alanin als Nebenprodukt gebildet. Durch einzelne Deletion der Gene für die Transaminase C (avtA) und die L-Alanin-Transaminase (alaT) mit L-Alanin-Spezifität konnte in einem L-Valin-Produktionsstamm eine Verringerung der L-Alaninakkumulation bei gleichzeitig erhöhter L-Valinbildung erreicht werden. Bei einer batch-Fermentation zeigte sich, dass die L-Alaninkonzentration im Kulturüberstand durch Verlust der AlaT-Aktivität um 75 % reduziert werden konnte.In the pathways of most amino acids transaminases reversibly catalyze the transfer of an amino group from an α-amino acid to an α-oxo-acid. Such enzymes are characterized by great sequence homology, similar structures and overlapping substrate specificities. The main objective of this thesis was to gain detailed knowledge of the structure and function of transaminases of Corynebacterium glutamicum with an emphasis on the enzymes participating in the synthesis of the three branched chain amino acids. Twenty proteins containing a transaminase motif were isolated and characterized concerning their substrate spectrum. The in vivo function was studied by chromosomal deletion mutants. Those experiments lead to the identification of the alanine transaminase AlaT and the aspartate transaminase AspC, which is important for lysinesynthesis. Two proteins could be assigned as cysteine desulfurases, which are involved in the assembly of FeS-clusters. The transaminase IlvE for the synthesis of the three branched chain amino acids catalyzes the formation of L-leucine, L-isoleucine and L-valine with comparable specific activities of 9.6 – 13.9 μmol min-1 mg (protein)-1. However, in vivo this enzyme is only essential for the L-leucine- and L-isoleucine-synthesis. The alanine-valine transaminase AvtA, which is strictly alanine-dependent, contributes also to the synthesis of the three branched chain amino acids and catalyzes the formation of valine with a high specific activity of 18.2 μmol min-1 mg (protein)-1. This activity alone ensures valine-synthesis in an ilvE-deletion mutant. The transaminase AroT is involved in the formation of L-phenyalanine and L-tyrosine. Interestingly, this enzymes catalyzes the conversion of 2-oxo-iso-caproate to L-leucine with less than 10 % of the specific activity of L-phenylalanine-synthesis from phenylpyruvate, but is unable to transaminate the precursors of L-isoleucine or Lvaline. Directed evolution generated an AroT-mutein with a M54L-mutation, which converts 2-oxo-iso-caproate to L-leucine with an almost doubled catalytic efficiency of 59 M-1 s-1. The histidinol-phosphate transaminase HisC was crystallized and a structure model up to a resolution of 1.8 Å was calculated. The model included 364 of 366 amino acids and gave information about the amino acid residues participating in the catalysis of this enzyme. The introduction of active-site mutations almost always resulted in a decreased activity of HisC, but a Y123F-mutation doubled the specific activity for the transamination of 4-hydroxy-phenylpyruvate to L-tyrosine (0.5 to 0.9 μmol min-1 mg (protein)-1). L-alanine accumulates during the microbial production of L-valine with C. glutamicum. Single deletion of the genes for the alanine-valine transaminase (avtA) and the alaninetransaminase (alaT) in the genome of a L-valine-production strain decreased the formation of this byproduct and increased the synthesis of L-valine. During a batchfermentation the loss of AlaT-activity reduced the L-alanine concentration in the culture filtrate by 75 %. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.12.2007 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.12.2007 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 10.08.0007 | |||||||
| Datum der Promotion: | 09.11.0007 |
