Dokument: Evaluierung des Proliferations- und Differenzierungsverhaltens von humanen Nabelschnurblutstammzellen nach Aussprossen aus dreidimensionalen Kulturen unterschiedlicher Größe
| Titel: | Evaluierung des Proliferations- und Differenzierungsverhaltens von humanen Nabelschnurblutstammzellen nach Aussprossen aus dreidimensionalen Kulturen unterschiedlicher Größe | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65108 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240327-105916-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Zapp, Madeline [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Depprich, Rita [Gutachter] Univ.-Prof. Dr. med. Nikolas H. Stoecklein [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die Wiederherstellung verloren gegangenen Knochens beziehungsweise die Überbrückung von knöchernen Defekten, die sowohl durch Traumata, aber auch Fehlbildungen, Neoplasien oder atrophische Prozesse verursacht sein können, stellt nach wie vor eine therapeutische Herausforderung in der klinischen Medizin dar. Auf der Suche nach Verfahren, mit denen Knochenersatzmaterialen sowohl in unbegrenzter Menge als auch ohne sekundäre Eingriffe beim Patienten hergestellt werden können, wurde das Bone Tissue Engineering (BTE) als Forschungsgebiet etabliert. Hier kann anhand gezielter Modulation von Stammzellen durch Variation von Differenzierungsfaktoren und der Extrazellulären Matrix (EZM) ein Gewebekonstrukt mit knochenähnlichen Eigenschaften in vitro nachgebildet werden. Das hohe Proliferationspotenzial von USSC (Unrestricted Somatic Stem Cell)– Linien, das ohne spontane Differenzierung oder Verlust der Plastizität in vitro nachgewiesen wurde, bietet besonders günstige Voraussetzungen für deren Einsatz. Für das BTE können so in vitro dreidimensionale, kugelige Gewebekonstrukte, sog. USSC-Mikromassen, hergestellt und verwendet werden, die durch das Aussprießen der Zellen eine flächenhafte Deckung und Heilung von Knochendefekten ermöglichen sollen.
In dieser Arbeit wurde der Frage nachgegangen, ob die vorteilhaften Eigenschaften der USSC-Linie auch nach Mikromassen-Formation erhalten bleiben. Zunächst wurde das Aussprossverhalten von USSC aus Mikromassen mit Zellzahlen von 45.000 (45Mm) und 90.000 (90Mm) mittels einer fluoreszierenden Kernfärbung (DAPI, 4′,6-Diamidino-2-phenylindol) untersucht. Während eines Zeitraums von 16 Tagen entwickelte sich ein flächendeckender Zellrasen aus vitalen USSC mit einem Radius von 8,97mm (SD 1,59mm) um die 90Mm. Ausläufer der 45Mm erreichten einen Radius von 7,4mm (SD 2,49mm) über den gleichen Zeitraum. Die Proliferationsaktivität ausgesprosster USSC der 45Mm bzw. 90Mm wurde mittels eines Proliferationsassays im Vergleich zu monolayerkultivierten USSC (ML-USSC) ermittelt. Die jeweiligen Versuchsgruppen wurden entweder mit dem Kulturmedium (DMEM) oder mit dem osteoblastären Differenzierungs-Medium (DAG: Dexamethason, Ascorbinsäure, β-Glyzerolphosphat) für weitere 11 Tage kultiviert. Trotz der weiterhin bestehenden Fähigkeit zur Proliferation stellte sich eine signifikant geringere Proliferationsaktivität bei ausgesprossten USSC beider Mikromassengrößen im Vergleich zu ML-USSC heraus. Zudem wurde der Mineralisierungsgehalt der extrazellulären Matrix (EZM) im Rahmen der osteoblastären Differenzierung von USSC bestimmt. Ausgesprosste USSC aus 45Mm wiesen den signifikant höchsten EZM-Mineralisierungsgehalt sowohl spontan unter DMEM als auch nach DAG-Stimulation auf. Weiterhin wurden in ML-USSSC, USSC aus 45Mm als auch ausgesprossten USSC aus 45Mm und 90Mm spezifische Marker, die als charakteristisch für Stammzellnischen-Eigenschaften gelten, mittels einer quantitativen Polymerase Kettenreaktion (PCR) untersucht. In der Expressionsanalyse dieser Marker fiel eine signifikant geringe Expression von Vinkulin und MT1-MMP in USSC aus 45Mm auf. Das erhaltene Expressionsprofil aller untersuchten Marker deutet jedoch auf den Erhalt der Stammzellnischen-Eigenschaften auch in ausgesprossten USSC beider Mikromassengrößen hin. In der Zusammenschau der Ergebnisse erweist sich die USSC-Mikromassen Technologie als vielversprechende Methode für das BTE. Eine Evaluation der Ergebnisse unter in vivo Bedingungen bleibt weiterhin offen.Bridging of osseus defects, that may occur after trauma but also as a consequence of malformation, neoplasia or atrophic processes, still represents a challenge for therapy in clinical medicine. In search of alternative concepts for treatment that may provide bone replacement material in sufficient amounts and as a consequence avoid secondary surgery Bone Tissue Engineering (BTE) was identified as a new field of research. By the use of targeted modulation of stem cells through variation of differentiation factors as well as the extracellular matrix (EZM) the formation of tissue constructs with bone-like properties becomes available in vitro. Their high potential of proliferation which has been proven in vitro to occur without spontaneous differentiation or loss of plasticity makes USSC-lines (unrestricted somatic stem cell-lines) particularly favorable for the use in BTE. Three-dimensional, globular tissue constructs termed as USSC micromasses can be fabricated for the use in covering bone defects with outgrowing cells and thus leading to the promotion of healing. In this thesis an evaluation of USSC cell lines regarding their potential to maintain their typical properties after having gone through a period of micromass formation has been performed. In a first approach differences in cell migration from micromasses consisting of 45,000 (45Mm) and 90,000 cells (90Mm) were measured by applying a fluorescent nuclear stain (DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole). Confluent cell layers of live USSC with an average radius of 8,97mm (SD 1,59mm) were detected in the 90Mm. In contrast, to these findings migrated cells from 45Mm were detectable at distances of 7,4mm (SD 2,49mm) in the same period of time. Proliferation activity of USSC migrating from 45Mm and 90 Mm was determined in a proliferation assay and compared to values obtained from monolayers of USSC (ML-USSC). Each test group was cultivated in growth medium (DMEM) or in an osteogenic differentiation medium including dexamethasone, ascorbic acid and β-glycerophosphate (DAG) for the duration of 11 more days. Although the proliferative potential of USSC which had migrated from micromasses of both sizes had been maintained, a significantly decreased proliferation activity in these groups was detected when compared to values obtained from ML-USSC. In order to evaluate the mineralization potential of migrated USSC from micromasses the mineral content of extracellular matrix of cells originating from 45Mm and from 90Mm was measured after 11 days of culture in DMEM or DMEM supplemented with DAG. As a result, significantly increased mineralization was detected in the extracellular matrix of sprouting 45 Mm subsequently to stimulation with DAG but also without any inductive supplements. The characteristic properties of the stem cell niche were investigated by determining the expression levels of specific markers in quantitative polymerase chain reaction (qPCR) experiments. No significant differences in ML-USSC as well as in sprouted USSC of all micromass sizes were observed. Interestingly, significant suppression of vinculin and MT1-MMP-expression levels in 45Mm was detected in these cells. Taking into account that the expression profile of USSC which have sprouted from micromasses reaches original levels these cells seem to have the potential to maintain features of the stem cell niche. As an overall result of the findings in this work USSC micromass technology showed promising results for its application in bone tissue engineering (BTE). Comparative measurements under in vivo conditions would be of special interest in future studies. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 27.03.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 27.03.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.03.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 05.12.2023 |
