Dokument: Funktions- und Strukturanalysen zur Charakterisierung des murinen GBP9 Proteins bei Infektionen mit intrazellulären Erregern
| Titel: | Funktions- und Strukturanalysen zur Charakterisierung des murinen GBP9 Proteins bei Infektionen mit intrazellulären Erregern | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=65018 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240222-143928-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Lichte, Jens [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Hegemann, Johannes [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Im Kontext der Zell-autonomen Immunität ist IFNγ ein potenter Expressions-Initiator hunderter verschiedener Gene, die die aktivierte Zelle auf Infektionen vorbereiten. Unter diesen Genen stellen insbesondere die Guanylat-bindenden Proteine (GBPs) eine wichtige Effektor-Gruppe dar, deren Funktion bislang noch nicht umfassend erforscht wurde. GBPs sind große GTPasen, die in uninfizierten Zellen in Vesikel-ähnlichen Kompartimenten (VLS)
vorkommen. Invadierenden Pathogenen widerfährt eine schnelle GBP-Akkumulierung an deren Art-spezifischen, Pathogen-assoziierten Vakuolen (PCVs) oder aber an deren Plasmamembran selbst. Die Akkumulierung an diesen Membranen, ist für einige der GBPs bereits als relevante Eigenschaft für die Kontrolle beispielsweise von Chlamydia (C.) trachomatis- und Toxoplasma (T.) gondii-Infektionen beschrieben worden. Viele der bisher nur wenig charakterisierten murinen GBPs (mGBPs) des mGBP-Clusters auf Chromosom 5 der Maus konnten bereits an PCVs beobachtet werden. Von diesen wies mGBP9 die höchsten Frequenzen an den chlamydialen Inklusionsmembranen auf, was auf eine spezifische Funktion von mGBP9 in Chlamydieninfektion hindeutet. Um die Funktion von mGBP9 detailliert zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit zunächst die Vorarbeiten für ein mGBP9-defizientes Mausmodell-System durchgeführt. Dazu wurde das CRISPR/Cas9 Genom-Editierungssystem in murinen embryonalen Stammzellen angewandt. Durch die eingesetzte mGBP9-Targeting Strategie konnte eine heterozygote mGBP9-defiziente ES-Zelllinie etabliert werden. Mittels dieser ES-Zelllinie können zukünftig mGBP9-defiziente Mäuse generiert werden, um die Funktion von mGBP9 in vivo zu untersuchen. Des Weiteren sollte die mGBP9-Funktion in NIH/3T3 Fibroblasten in vitro analysiert werden. Über eine weitere CRISPR/Cas9 Genom-Editierungsstrategie wurde in dieser Zelllinie ein fast vollständiger Chromosom 5 Cluster Knockout generiert (mGBP6KO,8V21M,9KO,10KO,11KO). In vitro Infektionen mit C. trachomatis und T. gondii zeigten allerdings keine signifikanten Unterschiede in der Pathogen-Replikation zwischen diesen und wildtypischen Zellen. In doppelt-transduzierten NIH/3T3 Fibroblastenlinien, die GFP-mGBP9 und weitere mCherry-gekoppelte mGBP-Fusionsproteine exprimierten, konnte eine nur seltene Lokalisation der mGBPs in VLS beobachtet werden. In infizierten Zellen war zudem eine seltene Re-Lokalisierung der mGBPs an die chlamydiale Inklusionsmembran zu erkennen. Dabei konnte neben mGBP9 auch mGBP8 an bereits rupturierten Inklusionsmembranen und in Co-Lokalisation mit intrazellulären Chlamydien beobachtet werden. Um die Protein-biochemischen Eigenschaften charakterisieren zu können, wurde des Weiteren ein His6-mGBP9 Fusionsprotein exprimiert und aufgereinigt. Anschließend wurde die GTPase-Aktivität bestimmt (Vmax 275,1 ± 19,07 nmol × min-1 × mg-1). Natives Protein wurde zusätzlich in der Kristallographie sowie in Kleinwinkel-Röntgenstreuungs-Analysen eingesetzt, um die mGBP9 Struktur zu lösen. Die Struktur-Analyse ergab bereits erste Ergebnisse und kann zukünftig fortgeführt werden, um eine höhere Auflösung zu erhalten. Als weiterer Teil wurde in dieser Arbeit ein mGBP9-spezifischer polyklonaler Antikörper generiert. In einem Western Blot mit Zelllysat aus verschiedenen GFP- oder mCherry-mGBP Fusionsprotein-exprimierenden NIH/3T3 Fibroblasten konnte eine sehr gute Erkennung von mGBP9 und eine Kreuzreaktivität des polyklonalen Antikörpers gegen mGBP3, 6, 8 und 10 bestimmt werden. Zusammenfassend konnten mit dieser Arbeit wichtige Schritte zur Charakterisierung der mGBP9-Funktion durchgeführt werden. Insbesondere das in Kürze verfügbare mGBP9- Defizienz-Mausmodell als auch die Auflösung der mGBP9-Proteinstruktur werden wegweisend in der Forschung dieser GTPase sein. Das Verständnis über die Funktion dieser GTPase-Familie könnte zukünftig zu neuen therapeutischen Ansätzen bei verschiedenen Infektionskrankheiten, die durch intrazelluläre Erreger ausgelöst werden, verhelfen.In the context of cell-autonomous immunity, IFNγ is a potent expression initiator of hundreds of different genes that prepare the activated cell for infection. Among these genes, guanylatebinding proteins (GBPs), in particular, represent an important effector group whose function has not yet been extensively studied. GBPs are large GTPases found in vesicle-like compartments (VLS) in uninfected cells. Invading pathogens undergo rapid GBP accumulation at their species-specific pathogen containing vacuoles (PCVs) or at their plasma membrane itself. Accumulation at these membranes has already been described for some of the GBPs as a relevant property for the control of, for example, Chlamydia (C.) trachomatis and Toxoplasma (T.) gondii infections. Many of the previously poorly characterized murine GBPs (mGBPs) of the mouse mGBP cluster on chromosome 5 have already been observed on PCVs. Of these, mGBP9 exhibited the highest frequencies at chlamydial inclusion membranes, suggesting a specific function of mGBP9 in chlamydial infection. To investigate the function of mGBP9 in detail, the preliminary work for an mGBP9-deficient mouse model system was first performed in this work. For this purpose, the CRISPR/Cas9 genome editing system was applied in murine embryonic stem (ES) cells. By applying this mGBP9 targeting strategy, a heterozygous mGBP9-deficient ES cell line could be established. Using this ES cell line, mGBP9-deficient mice can be generated to study the function of mGBP9 in vivo in the future. Furthermore, mGBP9 functions should be analyzed in NIH/3T3 fibroblasts in vitro. Via another CRISPR/Cas9 genome editing strategy, an almost complete chromosome 5 cluster knockout was generated in this cell line (mGBP6KO,8V21M,9KO,10KO,11KO). However, in vitro infections with C. trachomatis and T. gondii showed no significant differences in pathogen replication between these and wild-type cells. In double-transduced NIH/3T3 fibroblast lines expressing GFP-mGBP9 and other mCherry-coupled mGBP fusion proteins, only rare localization of mGBPs in VLS was observed. In infected cells, a rare re-localization of mGBPs to the chlamydial inclusion membrane was also evident. Here, in addition to mGBP9, mGBP8 was also observed at already ruptured inclusion membranes and in co-localization with intracellular chlamydiae. Furthermore, to characterize the protein biochemical properties, a His6-mGBP9 fusion protein was expressed and purified. Subsequently, GTPase activity was determined (Vmax 275,1 ± 19,07 nmol × min-1 × mg-1). Native protein was additionally used in crystallography as well as small angle X-ray scattering analyses to resolve the mGBP9 structure. The structural analysis yielded preliminary results in this regard and may be continued in the future to obtain a higher resolution. As another part, an mGBP9-specific polyclonal antibody was generated in this work. In a western blot with cell lysate from different GFP- or mCherry-mGBP fusion protein-expressing NIH/3T3 fibroblasts a very good recognition of mGBP9 and a cross-reactivity of the polyclonal antibody against mGBP3, 6, 8 and 10 could be determined. In summary, this work provided important steps towards the characterization of mGBP9 function. In particular, the soon to be available mGBP9 deficiency mouse model as well as the resolution of the mGBP9 protein structure will be groundbreaking in the research of this GTPase. In the future, understanding the function of this GTPase family could lead to new therapeutic approaches for various infectious diseases caused by intracellular pathogens. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 22.02.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 22.02.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 31.05.2021 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.06.2022 |
