Dokument: Multidisciplinary approach for mapping protein-protein interaction surfaces: from mass spectrometry to computational and cell biology

Titel:	Multidisciplinary approach for mapping protein-protein interaction surfaces: from mass spectrometry to computational and cell biology
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64796
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240221-075121-8
Kollektion:	Publikationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Castilla Porras, Francisco Javier [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 17,05 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.01.2024 / geändert 30.01.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Hidalgo, Patricia [Gutachter] Dr. Alfonso-Prieto, Mercedes [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In erregbaren Zellen koppeln spannungsgesteuerte Calciumkanäle (VGCC) elektrische Signale an eine Vielzahl zellulärer Prozesse, wie z.B. Hormonsekretion, Neurotransmission oder Muskelkontraktion. Diese heteromultimeren Kanäle bestehenhauptsächlich aus vier Untereinheiten (a1-, b-, g- und a2d-Untereinheit). Die α1-Untereinheit (Cavα1) und die β Hilfsuntereinheit (Cavβ) bilden den Kernkomplex des Kanals. Während Cavα1 die spannungsempfindliche Domäne (VSD) enthält und den Ionenleitungsweg bildet, moduliert Cavβ die biophysikalischen Eigenschaften und kontrolliert die Expression der Calciumkanäle an der Plasmamembran. Cavβ ist ein Protein, das zur MAGUK-Superfamilie gehört und aus zwei funktionellen Domänen besteht: einer Src-Homologie-3-Domäne (SH3) und einer Guanylatkinase-Domäne (GK). Cavβ entwickelte sich zu einem interaktiven Modul, das Homodimere bilden und mit mehreren Proteinen interagieren kann, wodurch seine funktionellen Fähigkeiten erweitert werden. Ein Mangel an Strukturdaten bzgl. dieser Interaktionen, führt dazu, dass wir bis heute die funktionelle Rolle nicht verstehen, die sie für das Schicksal von VGCC haben könnten. Mittels Cross-Linking Massenspektrometrie (XL-MS) und Protein-Protein Docking konnte ich die Interaktionsschnittstellen von Cavβ/F-Actin und Cavβ/Cavβ Komplexen aufdecken. Die strukturbasierte ortsgerichtete Mutagenese ermöglichte mir die Validierung von Hotspots, die dabei halfen, die Rollen der entsprechenden Cavβ/F-Actin und Cavβ/Cavβ Wechselwirkungen zu erkennen. Die Spaltung des Cavβ/F-Actin Komplexes führte zu einer verringerten Anzahl funktionell verfügbarer VGCC in der Membran, was auf eine Rolle dieser Wechselwirkung bei der Qualitätskontrolle von Kanälen an der Zelloberfläche schließen lässt. Außerdem zeigte die Untersuchung der Cavβ Dimerisierung, dass solche Dimere eine Kopf-Schwanz-Konformation annehmen, die durch eine Disulfidbrücke stabilisiert werden, von der zuvor berichtet wurde, dass sie funktionell relevant ist. Die in dieser Dissertation präsentierten Ergebnisse offenbaren zwei Cavβ Protein-Protein Schnittstellen, die den Funktionsstatus und die Verfügbarkeit von VGCC an der Plasmamembran regulieren. Somit stehen neue Kontaktoberflächen für die Medikamentensuche zur Verfügung, um gezielt Kanalfunktionsstörung bei VGCC-assoziierten Krankheiten behandeln zu können. Darüber hinaus deuten diese Ergebnisse auf ein Modell hin, in dem sich Cavβ/F-Actin und Cavβ/Cavβ Wechselwirkungen gegenseitig ausschließen, was eine strukturelle Grundlage dafür liefert, warum beide Wechselwirkungen unterschiedliche funktionelle Auswirkungen auf die Verfügbarkeit der VGCC-Membran haben. In excitable cells, voltage-gated calcium channels (VGCC) couple electrical signals to a variety of cellular processes such as hormone secretion, neurotransmission, or muscle contraction. These hetero-multimeric channels are mainly composed of four subunits (α1, β, g and a2d), being the α1 subunit (Cavα1) and the β auxiliary subunit (Cavβ) the core complex of the channel. Whereas Cavα1 contains the voltage-sensing domain (VSD) and forms the ion conduction pathway, Cavβ modulates the biophysical properties and controls the expression of the calcium channel at the plasma membrane. Cavβ is a protein belonging to the MAGUK superfamily and composed of two functional domains: an Src homology 3 (SH3) domain and a guanylate kinase (GK) domain. Cavβ evolved as an interactive module that can form homodimers and interact with multiple proteins expanding its functional capabilities. However, the lack of structural data on these interactions has hindered our understanding of the functional roles that they could have on VGCC fate. Here, by means of cross-linking mass spectrometry (XL-MS) and protein-protein docking, I uncovered the interaction interfaces of Cavβ/F-actin and Cavβ/Cavβ complexes. Structure-based site directed mutagenesis allowed for the validation of hotspots that help discern the roles of the corresponding Cavβ/F-actin and Cavβ/Cavβ interactions. First, the disruption of Cavβ/F-actin complex resulted in a decreased number of functionally available VGCC in membrane, suggesting a role of this interaction in the quality control of channels at the cell surface. Second, the study of Cavβ dimerization showed that such dimers adopt a head-to-tail conformation stabilized by a disulphide bridge previously reported to be functionally relevant. Altogether, the results presented in this thesis reveal two Cavβ protein-protein interfaces that regulate VGCC functional status and availability at the plasma membrane and provide novel druggable contact surfaces to target channel dysfunction in VGCC-associated disorders. Moreover, these results point out to a model where Cavβ/F-actin and Cavβ/Cavβ interactions are mutually exclusive, providing a structural basis why both interactions have different functional outcomes on VGCC membrane availability.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	21.02.2024
Dateien geändert am:	21.02.2024
Datum der Promotion:	25.01.2024