Dokument: Entwicklung und Anwendung einer RTX-Protein-basierten Produktionsplattform für Peptide und kleine Proteine
| Titel: | Entwicklung und Anwendung einer RTX-Protein-basierten Produktionsplattform für Peptide und kleine Proteine | |||||||
| Weiterer Titel: | Development and Application of a RTX protein-based production platform for peptides and small proteins | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64765 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20240209-093033-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Wetzel, Bach-Ngan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Lutz Schmitt [Gutachter] Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Strategien zur Herstellung rekombinanter Proteine sind häufig mit Problemen wie proteolytischem Abbau, Aggregation und Zytotoxizität gegenüber Wirtszellen oder hohen Produktionskosten verbunden, die ihren industriellen Einsatz in verschiedenen Bereichen erschwert. Diese Dissertation beschreibt die Entwicklung einer neuen und einzigartigen biochemischen Produktionsplattform für Peptide, Proteine und einer neuen proteinogenen Familie namens „Pepteine“, die viele der oben genannten Herausforderungen löst – NumaswitchTM. Diese Technologie basiert auf so genannte „Switchtags“, einer Gruppe von Fragmenten aus RTX-Proteinen mit charakteristischen Glycin-reichen Sequenzwiederholungen. Darunter zählt insbesondere das C-terminale Fragment von α-Hämolysin (HlyA), nämlich HlyA1. Zielpeptide, die an den C-Terminus von HlyA1 fusioniert sind, werden in Abwesenheit des Typ-1-Sekretionssystems (T1SS) für HlyA in E. coli als unlösliche Proteinaggregate produziert, die sich aber nach der Extraktion aus Zellen und Solubilisierung in chaotrope Agenzien in Gegenwart von Ca2+ effizient zu hochlöslichen und funktionellen Proteinen zurückfalten. Dieser Ansatz wurde zunächst für kleinere Peptide und anschließend für Pepteine mit bis zu 300 Aminosäuren entwickelt, die strukturell komplexer sind und bis zu drei Disulfidbrücken enthalten können. Bemerkenswert ist, dass die Fusion von verkürzten HlyA1-Varianten mit den ausgewählten Kandidaten zu höheren Renaturierungseffizienzen führen als mit dem Wildtyp HlyA1. Die Freisetzung der Peptide von HlyA1 nach proteolytischer Spaltung konnte erfolgreich durch analytische und biochemische Methoden nachgewiesen werden. Es konnte gezeigt werden, dass optimierte HlyA1 aber auch andere Fragmente aus RTX-Proteinen mit Glycin-reichen Sequenzwiederholungen als effiziente Protein-Tags fungieren können. Sie ebnen den Weg zu Vorteilen von Proteinaggregaten und lösen die gegenwärtige Problematik der effizienten Rückfaltung. Die Produktion von Teriparatid im Pilotmaßstab demonstriert das Potential der NumaswitchTM-Technologie Peptide im industriellen Maßstab und in höchster Qualität herzustellen. Des Weiteren liegt der Fokus dieser Dissertation auf der Entwicklung von antimikrobiell-adhäsiven Peptiden, die als Grundlage für die Funktionalisierung von Resomer®-basierten Implantatbeschichtungen zur Reduktion von Bakterienbesiedlung im Kampf gegen Implantat assoziierte Infektionen (IAIs) dienen können. Zur Identifikation von Peptidmotiven mit adhärenten Eigenschaften gegen Resomer® wurden Phage Display-Peptid-Bibliotheken erstellt und gegen Resomer®-Oberflächen gescreent. So wurde das Resomer®-bindende Peptid 2 (RBP2) entdeckt, welches mit drei ausgewählten antimikrobiellen Peptiden aus der Literatur fusioniert und mit der NumaswitchTM-Technologie hergestellt wurde. Die Erhaltung der antimikrobiellen und adhäsiven Eigenschaften der bifunktionellen Peptide wurden in verschiedenen Assays überprüft. Dabei zeigte sich, dass die bifunktionelle Peptide HBD3-RBP2 und DS THA antimikrobielle Wirkung gegen B. subtilis und adhäsive Eigenschaften gegenüber Resomer® aufwiesen. In ersten Machbarkeitsstudien konnte gezeigt werden, dass DS-THA nach Inkorporation in Resomer®-Beschichtungen erfolgreich das Wachstum von E. coli PKL1162 auf Oberflächen inhibierte.Strategies for recombinant protein production are frequently associated with challenges including proteolytic degradation, aggregation and cytotoxicity towards host cells or high production cost hampering application in various industries. This dissertation describes the development of a new and unique biochemical production platform for peptides, proteins and a new proteogenic family named “pepteins” that solves the above-mentioned challenges in many cases – NumaswitchTM. This technology is based on so-called “Switchtags”, a group of GG repeats containing fragments of RTX proteins which include the C-terminal fragment of α-hemolysin (HlyA), namely HlyA1. Target peptides fused to the C-terminus of HlyA1 were produced as inclusion bodies (IBs) in the absence of the HlyA type 1 secretion system (T1SS) in E. coli but extracted from cells and solubilized in chaotropic salts they were found to efficiently refold to highly soluble and functional proteins in the presence of Ca2+ ions. This approach was developed for peptides firstly and subsequently for pepteins up to 300 amino acids and complex structure proteins harboring up to three disulfide bridges. Remarkably, truncated HlyA1 variants in fusion to selected candidates led to higher renaturation efficiencies than HlyA1 wild type, and efficient release of targets from HlyA1 backbone was confirmed by analytical and biochemical methods after site-specific proteolysis. It was demonstrated that optimized HlyA1 fragments and other GG repeats containing fragments of RTX proteins are efficient and reliable protein tags granting access to advantages of IBs and solve the bottleneck of efficient refolding of IBs into functional proteins. Pilot scale production of one of the selected candidates, namely Teriparatide, demonstrated the capability of the NumaswitchTM approach to produce peptides in industrial-relevant scales and high qualities. Furthermore, this dissertation focused on the design of antimicrobial-adhesive peptides which may serve as foundation for the functionalization of Resomer®-based implant coatings to prevent bacterial growth in combat against implant-associated infections (IAIs). To identify peptide motifs with adhesive properties against Resomer® phagemid libraries displaying randomized peptides were constructed and used in biopanning experiments against the biopolymer. The emerging Resomer® binding peptide 2 (RBP2) were fused to three selected antimicrobial peptides (AMPs) extensively studied in the literature and produced by the NumaswitchTM technology. Different assays were established to determine whether the antimicrobial and adhesive functions in the bifunctional peptide were preserved. The bifunctional peptides HBD3-RBP2 and reference peptide DS-THA were demonstrated to exhibit antimicrobial activity against B. subtilis and adhesive properties against Resomer®. Proof-of-concept was demonstrated with DS-THA, which effectively inhibited the growth of E. coli PKL1162 strains on Resomer® coatings after incorporation. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.02.2024 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.02.2024 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 27.06.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 16.11.2023 |
