Dokument: Effects of macromolecular crowding on protein targeting and translocation via SecYEG

Titel:	Effects of macromolecular crowding on protein targeting and translocation via SecYEG
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64739
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240130-111210-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Löwe, Maryna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 30,17 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.01.2024 / geändert 24.01.2024
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Kedrov, Alexej [Gutachter] Prof. Dr. rer. nat. Hartmann, Laura [Gutachter]
Stichwörter:	p
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Das Zytoplasma der lebenden Zellen ist stark mit diversen Bio-Makromolekülen, wie Proteinen und Nucleinsäuren gefüllt, deren Konzentrationen bis zu 50-400 mg/mL erreichen können. Diese hohen intrinsischen Konzentrationen können bis zu 40% des verfügbaren Volumens einnehmen, während die heterogene Oberflächenbeschaffenheit von komplexen Makromolekülen die unspezifischen Wechselwirkungen zwischen ihnen fördert. Dieser Zustand wird in der wissenschaftlichen Literatur als „macromolecular crowding„ oder als makromolekulare Beengung bezeichnet. Vorhandene wissenschaftliche Untersuchungen haben gezeigt, dass die makromolekulare Beengung einen tiefgreifenden Einfluss auf die vitalen biologischen Prozesse in lebenden Zellen hat, darunter Diffusion, Proteinfaltung und aggregation sowie die Kinetik der enzymatischen Reaktionen. Die gleiche Situation findet auf und in den biologischen Membranen statt, welche in speziellen Fällen sogar bis zu 80% mit integralen Proteinen gefüllt sind. Auch hier sind vielfältige Auswirkungen von makromolekularer Beengung, wie Oligomerisierung und anomale Diffusion von Membranproteinen, sowie die durch die Proteinansammlungen hervorgerufenen morphologischen Veränderungen der Membranoberflächen, beschrieben. Die biologischen Prozesse, die in vitro in verdünnten Lösungen üblicherweise untersucht werden, spiegeln nicht die komplexen Bedingungen im Zytoplasma oder Membranen lebender Organismen wider. Um ein umfassendes Verständnis der komplexen Prozesse zu bekommen, ist es wichtig die makromolekulare Beengung in den Experimenten zu berücksichtigen. Dies erfordert die Nachahmung von Crowding-Bedingungen in physiologisch relevanten Umfang und einen Vergleich mit der tatsächlichen Situation in vivo. Bis jetzt existiert nur eine begrenzte Anzahl von Ansätzen, die es ermöglichen das Ausmaß der makromolekularen Beengung auf den Membranoberflächen zu charakterisieren. Daher wurde eine neue Generation genetisch-kodierter und membran-adaptierter Sensoren entwickelt, die eine Quantifizierung des Crowding auf der Membran in vitro ermöglichen und für Messungen in einer lebenden Zelle eingesetzt werden können In dieser Dissertation wurden synthetische sowie protein-basierte Crowders eingesetzt, um die komplexen und nativ-ähnlichen Bedingungen in der Lösung oder auf Membranoberflächen zu simulieren und die Auswirkungen auf die Funktionalität von SecYEG Translocon von E. coli zu charakterisieren. So konnte gezeigt werden, dass die synthetischen Polymere wie Ficoll PM70 und PEG in unterschiedlichen Größen eine Inhibierung von Transportprozessen hervorgerufen hat, die wiederum von dem Crowder-Typ, -Größe und -Konzentration abhängig war. Die simulierte makromolekulare Beengung auf den Oberflächen von Liposomen hat ebenfalls eine Verringerung der Transporteffizienz gezeigt. Die Etablierung und Charakterisierung dieser Systeme ermöglicht es, ein umfassenderes Verständnis zu bekommen, wie biologische Prozesse von komplexer zellulärer Umgebung beeinflusst werden und hilft damit verbundene methodologische Herausforderungen zu identifizieren. Cytoplasm of the living cell is highly crowded by biomacromolecules which occupy around 5-40% of the available volume and have a significant effect on thermodynamic and kinetic properties of vital biological processes, like protein folding and aggregation, enzymatic reactions, etc. Crowding effects are not limited to the cytoplasm, however, less attention has been paid to the crowding of biological membranes, where the integral membrane proteins can occupy from 25 to even 80% of available space thereby affecting lateral protein diffusion, oligomerization equilibria, favor formation of protein clusters and microdomains, whereas the presence of densely packed proteins at the membrane interface can affect membrane-associated processes like protein targeting and translocation, signaling and even lead to spontaneous membrane deformations. A comprehensive understanding of the implications of macromolecular crowding is essential for obtaining valuable insights how cellular organization and essential biological processes are influenced by complex cellular environments. Simulation and study of crowding effects in artificial systems requires a systematic reconstruction of crowding-induced confinement in the physiologically relevant range. However, so far only a limited number of approaches exist that would allow characterizing the extent of macromolecular confinement on the membrane surface. To work towards overcoming this limitation, a set of the genetically-encoded FRET-based sensors with different designs for probing the macromolecular crowding at the membrane interface were developed and characterized. The sensors allow for measurements of lateral confinement on membranes in vitro and are suitable for non-invasive crowding quantification and for study of membrane organization in living cells. In this thesis the development of model membranes systems with reconstituted SecYEG translocon was aimed to elucidate the effects of macromolecular crowding on post-translational protein targeting and translocation. A set of synthetic polymers as well as protein-based crowder were employed to simulate the complex and native-like conditions in solution or on membrane surfaces. It could be shown, that the synthetic polymers such as Ficoll PM70 and PEG of different sizes were able to inhibit the translocation rates and activity being dependent on the crowder´s type, size and concentration. Simulated macromolecular confinement on the surfaces of liposomes with synthetic polymers has also shown a reduction in transport efficiency, whereas protein-based crowder showed both, positive and negative modulating effect of translocation activity of preprotein. In summary, the establishment of these systems provides a starting point for study of macromolecular crowding effects in vitro and identifies associated methodological challenges.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	30.01.2024
Dateien geändert am:	30.01.2024
Promotionsantrag am:	27.09.2023
Datum der Promotion:	01.12.2023