Dokument: Strain- and process engineering for polyketides production with Pseudomonas taiwanensis VLB120 in two-phase cultivations

Titel:	Strain- and process engineering for polyketides production with Pseudomonas taiwanensis VLB120 in two-phase cultivations
Weiterer Titel:	Stamm- und Prozessentwicklung für Polyketidproduktion mittels Pseudomonas taiwanensis VLB120 in Zweiphasenkultivierungen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64725
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240205-111706-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schwanemann, Tobias Philipp [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 20,76 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.01.2024 / geändert 23.01.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Wierckx, Nick [Gutachter] Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Polyketide sind eine äußerst vielfältige Gruppe von Sekundärmetaboliten mit einem hohem Potenzial in zahlreichen Branchen und werden häufig biotechnologisch hergestellt. Bei Polyketiden werden gleiche Vorläufermoleküle zu komplexen Verbindungen mit sehr unterschiedlichen Eigenschaften zusammengesetzt; hierbei wird auf die gleichen zellulären Ressourcen zurückgegriffen. Folglich bestimmen die verwendeten Polyketidsynthasen (PKS) das finale Produkt, und der austauschbare Charakter der PKS ermöglicht die Herstellung verschiedener Verbindungen durch minimale Veränderungen des Wirtsorganismus. Insbesondere PKS III stellen aufgrund ihres simplen Aufbaus im Vergleich zu anderen PKS eine interessante Gruppe von Katalysatoren dar. In dieser Arbeit wurde ein alternativer bakterieller Produktionswirt, Pseudomonas taiwanensis VLB120, für die Produktion verschiedener Polyketidprodukte in Zweiphasenkulturen zur in situ Produktentfernung entwickelt. Die Bereitstellung von Malonyl-CoA ist oft der limitierende Schritt für die Polyketidsynthese durch PKS III in bakteriellen Wirten. Um die Verfügbarkeit zu erhöhen, wurden verschiedene Strategien des metabolic engineering zur rationalen Entwicklung eines Pseudomonas-Malonyl-CoA- Plattformstammes verwendet. Zunächst diente ein Stamm mit entfernten Aromatenabbauwegen als Grundlage. Die native periplasmatische Glukoseoxidation wurde ebenfalls entfernt, um die Glukoseverwertung über intrazelluläre NADPH-produzierende Reaktionsschritte zu erzwingen. Zusätzlich wurde der Acetyl-CoA-Knotenpunkt im zentralen Stoffwechsel durch veränderte Citrat- Synthase-Aktivität und zusätzliche Expression einer Acetyl-CoA-Carboxylase modifiziert. Eine Beschränkung der Fettsäurebiosynthese wurde durch die Implementierung einer alternativen β- Ketoacyl-ACP-Synthase II (FabF-2) mit anschließender Deletion und Austausch des nativen Enzyms durch eine einzigartige Identifizierungssequenz erreicht. All diese Modifikationen führten zu dem Malonyl-CoA-Plattform-Stamm Nr. 3, der in der Lage war, bis zu mehrere Milligramm Pinosylvin oder bis zu 84 mg/L Resveratrol zu produzieren. Der Titer von Flaviolin konnte zudem mehr als verdoppelt werden. Die Produktkonzentrationen der aus Malonyl-CoA hergestellten Produkte wurde durch die Verwendung eines alternativen Glukosetransporters weiter gesteigert, da der native Glukosetransport in Pseudomonaden Energie erfordert. Der Austausch oder die zusätzliche Expression des passiven Transporters Glf(Zm) (ursprünglich aus Zymomonas mobilis) ermöglichte die Produktion von bis zu 98 mg/L Resveratrol. Darüber hinaus wurde in einem Phenylalanin-Plattformstamm eine Steigerung der Zimtsäureproduktion um bis zu 10% erreicht. Aufbauend auf diesen Arbeiten wurden im nächsten Schritt mit den zuvor entwickelten Plattformstämmen mittels alternativer Vorläufermoleküle verschiedene Polyketide hergestellt, darunter erstmalige heterologe in vivo Biosynthesen und neuartige fluorierte Aromaten. Dazu wurde ein Screening geeigneter Enzymkombinationen durchgeführt und die Produkteigenschaften sowie die Wechselwirkung mit dem Wirt untersucht. Der festgestellten Produktinstabilität wurde durch die Anwendung von 2-Undecanon als zweite Phase zur in situ Produktaufarbeitung entgegengewirkt, welches aus einem Lösungsmittel-Screening hervorging. Dies führte schließlich zur de novo Synthese von 2,4,6-Trihydroxybenzophenon, 3,5-Dihydroxybiphenyl, 2,3',4,6-Tetrahydroxybenzophenon und 4- Hydroxycumarin in Zweiphasenkulturen. Polyketides are a highly diverse group of secondary metabolites with great potential for lead compounds for applications in multiple industries. Biotechnological hosts are frequently used for their heterologous production. For polyketide synthesis, identical precursors are assembled to complex compounds with highly different properties while using the same cellular resources. Consequently, the choice of polyketide synthase (PKS) determines the final product and the interchangeable nature of PKS allows the production of various compounds by minimal modifications of the host organism. In particular, PKS III represent an interesting group of catalysts due to their simplicity compared to other PKS. In this work, an alternative bacterial production host, Pseudomonas taiwanensis VLB120, was developed for the production of various polyketide products in two-phase cultivations for in situ product removal. Malonyl-CoA is often the limiting precursor for polyketide synthesis by PKS III in bacterial hosts. To increase its availability, different metabolic engineering strategies were applied for rational development of a Pseudomonas malonyl-CoA platform strain. Initially, a strain with removed catabolic pathways for aromatics served as the basis. Native periplasmic glucose oxidation was also deleted to force glucose utilization via intracellular NADPH-producing reaction steps. Additionally, the acetyl-CoA node in central metabolism was modified by altered citrate synthase activity and additional expression of an acetyl-CoA carboxylase. Inference of fatty acid biosynthesis was achieved by the implementation of an alternative β-ketoacyl-ACP synthase II (FabF-2) with subsequent deletion and exchange of the native enzyme by a unique identifier sequence. All these modifications resulted in the malonyl-CoA platform strain No. 3 which was able to produce up to several milligrams of pinosylvin, up to 84 mg/L resveratrol and flaviolin titers which were more than doubled compared to parental strains. The titers of the products made of malonyl-CoA was further enhanced by the use of an alternative glucose transporter since the native glucose transport of Pseudomonads requires energy. The replacement or additional expression of the passive transporter Glf(Zm) (originally from Zymomonas mobilis) enabled the production of up to 98 mg/L resveratrol. Additionally, an increase of up to 10% in cinnamate production in a phenylalanine platform strain was achieved. To go one step further, the previously developed platform strains were used to produce various polyketides using alternative precursor molecules, including first-time heterologous in vivo biosyntheses and new-to-nature fluorinated aromatics. For this purpose, screening of suitable enzyme combinations was performed and product properties as well as the interaction with the host were investigated. The observed product instability was counteracted by the application of 2-undecanone as a second phase for in situ product removal which emerged from a solvent screening. This eventually led to the de novo synthesis of 2,4,6-trihydroxybenzophenone, 3,5-dihydroxybiphenyl, 2,3',4,6- tetrahydroxybenzophenone and 4-hydroxycoumarin in two-phase cultivations.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Bezug:	2020-2023
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	05.02.2024
Dateien geändert am:	05.02.2024
Promotionsantrag am:	26.07.2023
Datum der Promotion:	26.10.2023