Dokument: Mutational and functional investigation of hemolysin A secretion in Escherichia coli

Titel:	Mutational and functional investigation of hemolysin A secretion in Escherichia coli
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64609
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240115-094501-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Anlauf, Manuel Tobias [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 96,73 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.01.2024 / geändert 11.01.2024
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Stichwörter:	Type 1 secretion system, T1SS, Hemolysin, ABC transporter, Escherichia coli, HlyA, HlyB
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Gram-negative Bakterien haben eine Vielzahl an Sekretionssystemen entwickelt, um Moleküle zu transportieren und mit ihrer Umgebung zu kommunizieren. Eines der einfachsten Systeme ist das Typ I Sekretionssystem (T1SS), dessen Kennzeichen der Transport von Substraten über die innere und äußere bakterielle Membran in einem ungefaltenen Zustand und ohne ein periplasmatisches Zwischenprodukt ist. Die Translokation wird über ein C-terminales Sekretionssignal vermittelt und von einem dreiteiligen Proteinkomplex ausgeführt, welcher aus einem ATP-binding cassette (ABC) Transporter und einem Membranfusionsprotein (MFP) in der inneren Membran sowie einem äußeren Membranprotein (OMP) besteht. Ein bekanntes Beispiel ist das Hämolysin A (HlyA) Sekretionssystem uropathogener Escherichia coli, in welchem der ABC Transporter Hämolysin B (HlyB) und das MFP Hämolysin D (HlyD) zusammen mit dem OMP TolC das 1024 Aminosäuren lange HlyA transportieren, ein Mitglied aus der repeats in toxins (RTX) Protein-Superfamilie. Zusätzlich zu der konservierten Nukleotid-bindenden Domäne (NBD) und Transmembrandomäne (TMD) weist HlyB eine N-terminale C39 Peptidase-ähnliche Domäne (CLD) auf. In dieser Dissertation wurde die Identität und das Zusammenspiel der Domänen von HlyB in Bezug auf die Sekretion untersucht. Die CLD, TMD und/oder NBD von HlyB wurden mit der entsprechenden Domäne des homologen ABC Transporters RtxB aus Kingella kingae ausgetauscht und die Fähigkeit der chimären Transporter, HlyA zu transportieren, quantifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass alle drei Domänen Spezifität für das sekretierte Substrat verleihen und während der Sekretion eng zusammenspielen. Die CLD ist die wichtigste Spezifitätsdeterminante, da ein Austausch zum vollständigen Wegfall der Sekretion führte. Einzelne Substitutionen der TMD oder NBD wurden toleriert, führten aber zu einer dreifach reduzierten Sekretion, während ein gleichzeitiger Austausch ebenfalls die Sekretion von HlyA verhinderte. Darüber hinaus wurden unnatürliche Aminosäuren erfolgreich in Proteine des Hämolysin Systems zur Photo-Quervernetzung eingeführt. Im arretierten Zustand vernetzte sich das in eGFP-HlyA eingebaute p-Benzoyl-L-Phenylalanin bei UV-Bestrahlung mit HlyB. Das Molekulargewicht der vernetzten Spezies lässt darauf schließen, dass sich während der Sekretion zwei Kopien von HlyA am Transporter befinden. Damit stehen nun die Mittel zur Verfügung, um den Translokationsweg von HlyA durch den Transporter zu kartieren. Gram-negative bacteria have developed a variety of secretion systems to transport molecules and communicate with their environment. One of the simplest arrangements is the Type I Secretion System (T1SS), whose hallmark is the transport of substrates across the inner and outer bacterial membrane in an unfolded state without the occurrence of a periplasmic intermediate. Translocation is mediated via a C-terminal secretion signal and accomplished by a tripartite protein complex consisting of an ATP-binding cassette (ABC) transporter and a membrane fusion protein (MFP) in the inner membrane and an outer membrane protein (OMP). One prominent example is the hemolysin A (HlyA) secretion system of uropathogenic Escherichia coli, in which the ABC transporter hemolysin B (HlyB) and MFP hemolysin D (HlyD) together with the OMP TolC transport the 1024 amino acid long HlyA, a member of the repeats in toxin (RTX) protein superfamily. In addition to the conserved nucleotide binding domain (NBD) and transmembrane domain (TMD), HlyB features an N-terminal C39 peptidase-like domain (CLD). During this thesis, the identity and interplay of the domains of HlyB in respect to secretion were investigated. The CLD, TMD and/or NBD of HlyB were exchanged with the respective domain of the homologous ABC transporter RtxB from Kingella kingae and the ability of the chimeric transporters to transport HlyA was quantified. It was shown, that all three domains confer specificity for the secreted substrate and play closely together during secretion. The CLD is the most important specificity determinant, as an exchange led to complete abolishment of secretion. Single substitutions of either the TMD or NBD were tolerated but showed a threefold reduced secretion, while a simultaneous exchange also inhibited secretion of HlyA. Furthermore unnatural amino acids were successfully introduced into proteins of the hemolysin system for photo-crosslinking. In the stalled complex, p-benzoyl-L-phenylalanine incorporated into eGFP-HlyA crosslinked to HlyB upon UV irradiation. The molecular weight of crosslinked species suggests the presence of two copies of HlyA at the transporter during secretion. With this, the means to map the translocation pathway of HlyA through the transporter are finally in hand.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	15.01.2024
Dateien geändert am:	15.01.2024
Promotionsantrag am:	16.11.2023
Datum der Promotion:	18.12.2023