Dokument: Die Degeneration primärer humaner valvulärer Interstitialzellen unter dem Einfluss aktivierter endothelialer small extracellular vesicles
| Titel: | Die Degeneration primärer humaner valvulärer Interstitialzellen unter dem Einfluss aktivierter endothelialer small extracellular vesicles | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64424 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20231214-134545-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Daugs, Katharina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Akhyari, Payam [Gutachter] Prof. Dr. med. Filler, Timm [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Kardiovaskuläre Erkrankungen zählen zu den häufigsten Todesursachen weltweit. Dabei ist in Industrienationen die Aortenklappenstenose (AKS) die häufigste Herzklappenerkrankung der älteren Bevölkerung. Der AKS liegt neben kardiovaskulären Risikofaktoren ein progredienter Pathomechanismus, die kalzifizierende Aortenklappenerkrankung (CAVD), zugrunde. Auslösende endotheliale Dysfunktion und Inflammation sowie pathologische Differenzierung beteiligter valvulärer Endothel- (VEC) und Interstitialzellen (VIC) resultiert in Fibrose und Kalzifizierung der Aortenklappe (AK). Ist die Öffnungsfläche der AK einmal kalzifizierend eingeschränkt und für die entsprechenden Patienten symptomatisch, bleibt trotz intensiver Forschungsbemühungen derzeit nur der operative Aortenklappenersatz. Daher gilt es den Pathomechanismus der CAVD weiter aufzuklären und effektive, anderweitige Therapieoptionen voranzutreiben.
(Small) Extrazelluläre Vesikel (SEV/EV), welche der physiologischen Zell-Zell-Kommunikation dienen, könnten sich diesbezüglich als vielversprechende Zielstruktur abzeichnen. EV können unter pathologischen Bedingungen an Initiierung und Aufrecht-erhaltung der CAVD beteiligt sein. Inwieweit endotheliale EV die pathologische Differenzier-ung der VIC vor dem Hintergrund der CAVD fördern können, ist jedoch derzeit ungeklärt. Innerhalb der vorliegenden Promotionsarbeit wurden primäre VEC und VIC mittels Magnetic Activated Cell Sorting aus humanen AK isoliert. Initial wurden VEC unter degenerativen bzw. inflammatorisch aktivierenden Bedingungen (Transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) bzw. Tumor nekrosis factor alpha (TNF-α)) kultiviert. Auf Proteinebene wurde eine Endothelial to mesenchymal transition untersuchter VEC anhand signifikant gesteigerter Expression gängiger Marker nachgewiesen (ICAM: Ktrl.: 1,0 vs. TNF-α: 54,0 ± 16,93, p=0,0005 und VCAM: Ktrl.: 1,0 vs. TNF-α: 81,05 ± 35,52, p=0,0001 und α-SMA: Ktrl.: 1,0 vs. TGF-β1: 1,597 ± 0,181). Im Anschluss erfolgte die Isolation von SEV aus den endothelialen Kulturüberständen mittels ExoQuick - TC Precipitation Solution sowie die Quantifizierung der SEV durch die Nanopartikel-Tracking-Analyse. Bei zunehmender, aktivierender Kultivierungsdauer der VEC zeigte sich nach 7 Tagen eine signifikant gesteigerte Freisetzung von SEV (Ktrl.: 1,00 vs. TNF-α: 1,297 ± 0,097, p=0,0235). Die Degeneration der VIC durch β-Glycerolphosphat-Dinatriumsalz-Pentahydrat, Calcium-Chlorid sowie den endothelial aktivierten SEV, wurde auf Proteinebene mittels Western-blot-Analysen und Alizarinrot-Färbung zum Nachweis von Kalziumkomplexen erfasst. Hierbei zeigte sich die Degeneration der VIC unbeeinflusst von SEV einer unbehandelten, endothelialen Kontrollkultur (Alizarinrot-Färbung: Ktrl.: 1,0 vs. DEG: 3,098 ± 0,926 p=0,0064; Ktrl.: 1,0 vs. Ktrl.-SEV: 2,298 ± 0,995; Ktrl.: 1,0 vs. Ktrl. konditioniertes Medium (KM): 1,071 ± 0,107; αSMA/Vimentin-Proteinratio: Ktrl.: 1,0 vs. DEG: 1,134 ± 0,236; Ktrl.: 1,0 vs. Ktrl.-SEV: 1,165 ± 0,339; Ktrl.: 1,0 vs. Ktrl.-KM: 1,246 ± 0,197). Unter Addition aktivierter, endothelialer SEV erwies sich die Degeneration der VIC teilweise jedoch als statistisch signifikant gesteigert (Alizarinrot-Färbung: DEG: 1,0 vs. DEG+TGF-β1-SEV: 2,109 ± 0,733; DEG: 1,0 vs. DEG+TNFα-SEV: 2,633 ± 0,687, p=0,0252; αSMA/Vimentin- Proteinratio: DEG: 1,0 vs. DEG+ TGF-β1-SEV: 1,336 ± 0,251; DEG: 1,0 vs. DEG+ TNFα- SEV: 1,786 ± 0,44). Unter pathologischer Inflammation fördern endotheliale SEV vor dem Hintergrund der CAVD also die in-vitro Degeneration von VIC. Dieser Effekt lässt sich nicht auf die bloße Anwesenheit der SEV zurückführen. Vielmehr scheint eine pathologisch induzierte Veränderung der SEV durch Schädigung der Ursprungszellen ursächlich zu sein. Weitere in-vitro Analysen, auch hinsichtlich der Zusammensetzung von SEV, könnten angeschlossen werden, um perspektivisch SEV in Diagnostik und Therapie der AKS zu etablieren.Cardiovascular diseases rank among the most prevalent causes of mortality worldwide. In industrialized countries, aortic valve stenosis (AVS) is the most common heart valve disease in the elderly population. In addition to cardiovascular risk factors, AVS is based on a progressive pathomechanism, namely calcific aortic valve disease (CAVD). Triggering endothelial dysfunction and inflammation as well as pathological differentiation of involved valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) results in fibrosis and calcification of the aortic valve (AV). Once the orifice area of the AV is restricted by calcification and symptomatic for the respective patients, the only option currently available despite intensive research efforts is surgical aortic valve replacement. Therefore, it is important to further elucidate the pathomechanism of CAVD and to advance effective, alternative therapy options. (Small) Extracellular vesicles (SEV/EV), which serve physiological cell-cell communication, could emerge as a promising target structure in this regard. EVs may be involved in the initiation and maintenance of CAVD under pathological conditions. However, the extent to which endothelial EVs can promote pathological differentiation of VIC against the background of CAVD is currently unclear. In this doctoral thesis, primary VEC and VIC were isolated from human AV using Magnetic Activated Cell Sorting. Initially, VEC were cultured under degenerative or inflammatory activating conditions (transforming growth factor beta 1 (TGF-β1) or tumour necrosis factor alpha (TNF-α), respectively). At the protein level, an endothelial to mesenchymal transition of investigated VEC was detected by significantly increased expression of common markers (ICAM: Ctrl.: 1,0 vs. TNF-α: 54,0 ± 16,93, p=0,0005) and VCAM: Ctrl.: 1,0 vs. TNF-α: 81,05 ± 35,52, p=0,0001 and αSMA: Ctrl.: 1,0 vs. TGF-β1: 1,597 ± 0,181). Subsequently, SEVs were isolated from the endothelial culture supernatants using ExoQuick - TC Precipitation Solution and quantified by nanoparticle-tracking-analysis. With increasing, activating cultivation time of the VEC, a significantly increased release of SEV was shown after 7 days (Ctrl.: 1,00 vs. TNF-α: 1,297 ± 0,097, p=0,0235). Degeneration of VIC by β-glycerol phosphate disodium salt pentahydrate, calcium chloride as well as the endothelially activated SEV, was assessed at the protein level by Western-blot-analyses and alizarin-red-staining to detect calcium complexes. Here, the degeneration of VIC was shown to be unaffected by SEVs of an untreated, endothelial control culture (alizarin-red-staining: Ctrl.: 1,0 vs. DEG: 3,098 ± 0,926 p=0,0064; Ctrl.: 1,0 vs. Ctrl.-SEV: 2,298 ± 0,995; Ctrl.: 1,0 vs. Ctrl. conditioned medium (CM): 1,071 ± 0,107; αSMA/Vimentin-proteinratio: Ctrl.: 1,0 vs. DEG: 1,134 ± 0,236; Ctrl.: 1,0 vs. Ctrl.-SEV: 1,165 ± 0,339; Ctrl.: 1,0 vs. Ctrl.-CM: 1,246 ± 0,197). However, with the addition of activated endothelial SEVs, the degeneration of VIC proved to be statistically significantly increased (alizarin-red-staining: DEG: 1,0 vs. DEG+TGF-β1-SEV: 2,109 ± 0,733; DEG: 1,0 vs. DEG+TNF-α-SEV: 2,633 ± 0,687, p=0,0252; αSMA/Vimentin-proteinratio: DEG: 1,0 vs. DEG+TGF-β1-SEV: 1,336 ± 0,251; DEG: 1,0 vs. DEG+ TNFα-SEV =1,786 ± 0,44). Thus, under pathological inflammation, endothelial SEVs promote the in vitro degeneration of VIC against the background of CAVD. This effect cannot be attributed to the mere presence of the SEV. Rather, a pathologically induced change in the SEVs through damage to the cells of origin appears to be causative. Further in-vitro analyses, also with regard to the composition of SEVs, could be carried out in order to establish SEV in the diagnostics and therapy of AVS. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 14.12.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 14.12.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 12.09.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 12.12.2023 |
