Dokument: Molekulare und funktionale Analyse der nicht-kodierenden Kontrollregion (NCCR) des humanen Polyomavirus JC bei Patienten mit einer progressiven multifokalen Leukenzephalopathie (PML)

Titel:	Molekulare und funktionale Analyse der nicht-kodierenden Kontrollregion (NCCR) des humanen Polyomavirus JC bei Patienten mit einer progressiven multifokalen Leukenzephalopathie (PML)
Weiterer Titel:	Molecular and functional analysis of the non-coding control region (NCCR) of human polyomavirus JC in patients with progressive multifocal leukoencephalopathy (PML)
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64394
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20231218-081950-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schmitz, Cornelia Regina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,04 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.12.2023 / geändert 11.12.2023
Beitragende:	Prof. Dr. med. Adams, Ortwin [Gutachter] Professor Aktas, Orhan [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das John-Cunningham-Virus (JCV) gehört zur Gruppe der humanen Polyomaviren und ist ein kleines, unbehülltes Virus mit zirkulärer, doppelsträngiger DNA. Der Erstkontakt mit dem JCV-Ursprungstyp („Archetyp“) ereignet sich in der Regel im frühen Jugendalter und die weltweite Durchseuchungsrate liegt bei ca. 40%-60%. Dieser Archetyp persistiert lebenslang vorzugsweise im Urogenitaltrakt, im Knochenmark, in Lymphozyten und potenziell auch im ZNS. Unter Immunsuppression des Wirts (z.B. HIV-Infektion, immunsuppressive Therapie mit monoklonalen Antikörpern) ist das reaktivierte JC-Virus Verursacher der progressiven multifokalen Leukenzephalopathie (PML), einer lebensbedrohlichen, neurologischen Erkrankung. Voraussetzung für die Entstehung der PML scheint die Veränderung in einer Genregion des Virus zu sein, der Non-coding control region (NCCR), einer nicht kodierenden Region, die kontrollierend auf die Transkription angrenzender Proteine der frühen und späten Genexpression wirkt. Diese Veränderung der NCCR-Archetypsequenz hin zur „PML-Typ-NCCR-Sequenz“ ist gekennzeichnet durch hochkomplexe Rearrangements, Deletionen und Insertionen der 6 Sequenzblöcke a-f, die in der NCCR definiert sind. Diese Arbeit soll Erkenntnisse über die verschiedenen Veränderungen und Mutationen in der NCCR geben sowie über das Vorhandensein von Minorvarianten. Die Majorvarianten/Consensussequenzen der JCV-NCCR-Sequenzen wurden mittels Sangersequenzierung und Minorvarianten durch Tiefensequenzierung bestimmt. Die dabei gefundenen Mutationen wurden funktionell hinsichtlich ihrer Auswirkungen auf die Promotoraktivität und Replikationsfähigkeit untersucht. Dies geschieht in einem bidirektionalen Reporterplasmid, bei dem die Expression der Fluorophore als Korrelat für die frühe bzw. späte Promotoraktivität mittels Durchflusszytometrie gemessen wird. Die Sequenzanalyse der Mutationen in den zeitgleich entnommenen Serum- und Liquorproben soll Aufschluss darüber geben, ob die Verteilung von distinkten Minor- und Majorvarianten in der Peripherie und im Liquorraum Regeln unterliegt oder individuell unterschiedlich ist. Dies könnte Hinweise darauf geben wo, anatomisch gesehen, und wie der Switch vom Archetyp zum neurovirulenten PML-Typ stattfindet. Für diese Untersuchung wurden insgesamt 26 JCV-DNA positive Proben (13 Liquor- und 13 Serum-proben) analysiert – darunter 10 Liquor- und Serumprobenpaare von 10 PML-Patienten. 25 der 26 untersuchten JCV-NCCR-Sequenzen zeigten Veränderungen im Vergleich zum Archetyp, eine Probe wies exakt die Archetypsequenz auf. Häufige Veränderungen (Rearrangements, Deletionen, Insertionen, Duplikationen, Einzelnukleotidveränderungen/Punktmutationen) zeigten sich in den Sequenzblöcken c, d und e. Es konnte kein einheitliches Bild beim Vergleich der patientenindividuellen Liquor-NCCR-Consensussequenz mit der jeweiligen Serum-Consensussequenz festgestellt werden; bei 3 der 10 Probenpaare war die Consensussequenz in Liquor und Serum unterschiedlich, bei 7 hingegen war sie identisch. In 23 der 26 Patientenproben konnten Minorvarianten detektiert werden, die entweder nur vereinzelte Punktmutationen/ Einzelnukleotidveränderungen im Vergleich zur zugehörigen Majorvariante aufwiesen oder Varianten mit größeren Veränderungen und Rearrangements im Vergleich zur dominierenden Consensussequenz zeigten. Auch hier ergab sich kein einheitliches Bild bzgl. der Verteilung von Minorvarianten in Liquor- und korrespondierender Serumprobe. 24 der 26 Proben zeigten eine signifikante Steigerung der frühen Promotoraktivität im Vergleich zum Archetypniveau, bei der späten Promotoraktivität konnte sowohl eine signifikante Steigerung als auch eine signifikante Abnahme im Vergleich zum Archetyp beobachtet werden. Zusammenfassend kann man sagen, dass es eine starke Assoziation zwischen einer veränderten NCCR und der Manifestation der PML gibt. Das nicht einheitliche Verteilungsmuster der Consensus-sequenzen in Liquor und Serum deutet daraufhin, dass der Krankheitsprozess nicht bei allen PML-Patienten gleich ist. Das Vorkommen unterschiedlicher Minorvarianten in Liquor und Serum spricht für einen unabhängigen in beiden Kompartimenten vorkommenden Selektionsprozess. Die PML-spezifischen Mutationen in der NCCR führen zu einer Zunahme der frühen Promotoraktivität, wodurch letztendlich die Replikationsfähigkeit und Virulenz des Virus gesteigert wird. Die Ergebnisse geben sowohl Hinweise für eine hämatogene virale Route (NCCR-Varianten entstehen in der Peripherie und wandern dann ins ZNS) als auch für einen Prozess, in dem das JCV im ZNS ruht und vor Ort Veränderungen im Rahmen der Reaktivierung unterläuft. Beide Hypothesen sind denkbar und es könnte zwei unterschiedliche Pathomechanismen und virale Routen bei PML-Patienten geben. John Cunningham virus (JCV) belongs to the human polyomavirus group and is a small, non-enveloped virus with circular, double-stranded DNA. Initial contact with the JCV original type ("archetype") usually occurs in early adolescence and the global rate of infection is approximately 40%-60%. This archetype persists throughout life, preferentially in the genitourinary tract, bone marrow, lymphocytes, and potentially the CNS. Under host immunosuppression (e.g., HIV infection, immunosuppressive therapy with monoclonal antibodies), reactivated JC virus is the causative agent of progressive multifocal leukoencephalopathy (PML), a life-threatening neurological disease. A prerequisite for the development of PML appears to be an alteration in a gene region of the virus, the noncoding control region (NCCR), a noncoding region that has a controlling effect on the transcription of adjacent proteins of early and late gene expression. This change in the NCCR archetype sequence to the "PML-type NCCR sequence" is characterized by highly complex rearrangements, deletions, and insertions of the 6 sequence blocks a-f defined in the NCCR. This work aims to provide insights into the various alterations and mutations in the NCCR, as well as the presence of minor variants. The major variants/consensus sequences of the JCV-NCCR sequences were determined by sanger sequencing and minor variants by deep sequencing. The mutations found were functionally analyzed for their effects on promoter activity and replication capacity. This is done in a bidirectional reporter plasmid in which the expression of fluorophores is measured as a correlate for early or late promoter activity by flow cytometry. Sequence analysis of mutations in serum and CSF samples collected at the same time will provide information on whether the distribution of distinct minor and major variants in the periphery and CSF space is subject to rules or varies between individuals. This could provide clues as to where, anatomically, and how the switch from archetype to neurovirulent PML type occurs. For this study, a total of 26 JCV DNA positive samples (13 CSF and 13 serum samples) were analyzed-including 10 CSF and serum sample pairs from 10 PML patients. Twenty-five of the 26 JCV-NCCR sequences examined showed alterations compared with the archetype, and one sample had the exact archetype sequence. Frequent changes (rearrangements, deletions, insertions, duplications, single nucleotide changes/point mutations) were seen in sequence blocks c, d, and e. No consistent picture could be found when comparing the patient-specific CSF NCCR consensus sequence with the respective serum consensus sequence; in 3 of the 10 pairs of samples, the consensus sequence was different in CSF and serum, whereas in 7 it was identical. In 23 of the 26 patient samples, minor variants could be detected, which either showed only isolated point mutations/single nucleotide changes compared to the corresponding major variant or variants with larger changes and rearrangements compared to the dominant consensus sequence. Again, there was no uniform picture regarding the distribution of minor variants in CSF and corresponding serum samples. 24 of the 26 samples showed a significant increase in early promoter activity compared to the archetype level, and in late promoter activity both a significant increase and a significant decrease could be observed compared to the archetype. In conclusion, there is a strong association between altered NCCR and manifestation of PML. The nonuniform distribution pattern of consensus sequences in CSF and serum suggests that the disease process is not the same in all PML patients. The presence of different minor variants in CSF and serum suggests an independent selection process occurring in both compartments. The PML-specific mutations in NCCR lead to an increase in early promoter activity, ultimately increasing the replicative capacity and virulence of the virus. The results provide evidence for both a hematogenous viral route (NCCR variants arise in peri-phery and then migrate to the CNS) and a process in which JCV is dormant in the CNS and undergoes on-site changes as part of reactivation. Both hypotheses are conceivable and there could be two distinct pathomechanisms and viral routes in PML patients.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	18.12.2023
Dateien geändert am:	18.12.2023
Promotionsantrag am:	04.06.2023
Datum der Promotion:	05.12.2023