Dokument: Membrane translocation and chaperone-dependent folding of the lipase A of Pseudomonas aeruginosa

Titel:	Membrane translocation and chaperone-dependent folding of the lipase A of Pseudomonas aeruginosa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64328
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20231212-091016-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Papadopoulos, Athanasios [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 25,09 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.12.2023 / geändert 06.12.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Kedrov, Alexej [Gutachter] Prof. Dr. Karl-Erich Jaeger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die Lipase A ist ein Virulenzfaktor des opportunistischen Humanpathogens Pseudomonas aeruginosa. Die Biogenese der Lipase ist ein komplexer Prozess, bei dem das Protein mit vielen weiteren Protein interagiert, um in seine aktive Form gefaltet und in den extrazellulären Raum sekretiert zu werden. Die Aufklärung der Biogenese der Lipase kann dazu dienen, die Pathogenität von P. aeruginosa zu verringern. Die Lipase A wird Sec-abhängig in das Periplasma exportiert, wo das Protein durch die Lipase-spezifische Foldase (LipH) in seinen aktiven Zustand gefaltet wird, bevor es durch das T2SS in den extrazellulären Raum sekretiert wird. Die Synthese und die Sec-abhängige Translokation der Lipase A sind wichtige und initiale Schritte der Lipase-Biogenese. Um den Transportprozess der Lipase A zu untersuchen, wurde das Sec-System von P. aeruginosa PAO1 in vitro rekonstituiert und die Lipase-Translokation analysiert. Dies erforderte die heterologe Expression, Reinigung und Charakterisierung des Pseudomonas-Sec-Systems (SecYEG, SecA und SecB) sowie des Translokationssubstrats (proLipA). Die Transporteffizienz des Pseudomonas-Sec-System ist ähnlich zum Sec-Referenzsystem von E. coli, sofern das Modellsubstrat proOmpA benutzt wurde. Der Transport der Lipase A (proLipA) ist gering, was wahrscheinlich auf intermediäre Faltung oder Aggregation des Proteins zurückzuführen ist. Es wurden vielfältige Versuche unternommen, um die Transporteffizienz der Lipase zu verbessern, u. a. durch den Einsatz verschiedener Chaperone, der Kreierung einer stabileren Lipase-Variante und einer weniger spezifische Translokonvariante, welche jedoch keine vergleichbare Transporteffizienz zu proOmpA ergaben. Um Einblicke in die Faltung und Reifung der Lipase A zu erhalten, wurde die Lipase-spezifische Foldase in ihrer vollen Länge (LipHFL) exprimiert und aus der Membran isoliert. Das gereinigte LipHFL wurde in Modellmembransystemen (Proteoliposomen und Nanodiscs) rekonstituiert, die in der Lage waren, die Lipase zu aktivieren. Darüber hinaus wurden die Interaktionen zwischen Lipase und Foldase mittels Strukturanalyse untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine hochflexible Chaperon-Domäne der Foldase und einen Lipase:Foldase Komplex mit einer 1:1-Stöchiometrie. Um festzustellen, ob die Foldase an der Translokation der Lipase beteiligt ist bzw. frühe Translokationsintermediate der Lipase erkennt, wurden N- und C-terminal verkürzte Lipase-Varianten erzeugt und für Interaktionsstudien verwendet. Während die Foldase mit der C-terminal verkürzten Lipase interagiert, konnte keine Bindung zur N-terminal verkürzten Lipase-Variante festgestellt werden, was darauf hindeutet, dass die Foldase in der Lage ist frühe Translokationsintermediate der Lipase zu erkennen. Zusätzlich wurde die Co-Expression der foldase und des Translokons bewerkstelligt und isolierte IMVs für vorläufige in-vitro-Transportstudien verwendet. Da die Lipase A stark zur Aggregation neigt und Faltungshilfe benötigt, wurden die Wechselwirkungen mit den weiteren prominenten periplasmatischen Chaperonen aus P. aeruginosa FkpA, SurA, Skp, YfgM und PpiD untersucht, um zu ermitteln, ob diese Proteine an der Lipase-Biogenese beteiligt sind. Das periplasmatische Chaperon Skp verhindert die Aggregation der ungefalteten Lipase in vitro und beeinflusst die Lipase-Sekretion in vivo. Die trimere Struktur von Skp aus P. aeruginosa PAO1 wurde mittels Röntgen-Kleinwinkelstreuung (SAXS) aufgeklärt, wobei die offene und die geschlossene Konformation des Chaperons identifiziert werden konnten. Weitere Interaktionsstudien ergaben zwei Bindungsmodi für LipA:Skp-Interaktionen mit einer Stöchiometrie von 1:1 bzw. 1:2, welche eine Bindungsaffinität von 20 nM und 2 µM haben. Skp stabilisiert die Lipase über apolare Wechselwirkungen, welche durch erhöhte Salzkonzentrationen nicht beeinträchtigt werden. Skp ist daher ein wirksamer Modulator bei der Lipase-Biogenese, der die Aggregation verhindert, die Stabilisierung unterstützt und den Übergang von LipA zu LipH fördert. Zusätzliche Strukturanalyse der periplasmatischen Chaperone wurden getätigt und können für weitere Arbeiten herangezogen werden. Die vorliegende Arbeit bildet die Grundlage für weitere Untersuchungen zur Aufklärung der Biogenese von sekretorischen Proteinen, die als Virulenzfaktoren von bakteriellen Krankheitserregern dienen. The lipase A represents a virulence factor of the opportunistic human pathogen Pseudomonas aeruginosa. Upon lipase biogenesis, the protein is exported Sec-dependently to the periplasm where it obtains folding assistance for maturation by its cognate foldase LipH. The matured lipase is then secreted by the type II secretion system (T2SS) to the extracellular space. Elucidating the biogenesis of the lipase can may serve to reduce the pathogenicity of P. aeruginosa. The synthesis and Sec-dependent translocation of the lipase A are important initial steps upon lipase biogenesis. To understand the transport process of the lipase A, the Sec system of P. aeruginosa PAO1 was reconstituted in vitro. This required the heterologous expression, purification, and characterization of the Pseudomonas Sec system (SecYEG, SecA and SecB), as well as the lipase A precursor (proLipA) as translocation substrate. The Pseudomonas Sec system manifested equal transport efficiency in vitro as the reference Sec system of E. coli when commonly utilized model substrate (proOmpA) was used with either proteoliposomes or inner membrane vesicles. However, the transport efficiency of proLipA remained low, likely due to partial folding and/or instant aggregation of the protein. Extensive efforts were made to improve the lipase transport efficiency, including optimization of targeting to Sec by various chaperones, creation of a more stable lipase variant, and a less specific variant of the translocon, but did not indicate comparable transport efficiency to proOmpA. To obtain insights on the folding and maturation of the lipase A, its cognate chaperone, the full-length foldase (LipHFL), was overexpressed and isolated from the membrane. LipHFL was purified and reconstituted in a model membrane system (proteoliposomes and nanodiscs), which were both capable of activating the lipase. Structural analysis of the soluble domain of LipH and LipA:LipH complex by small-angle X-ray scattering revealed a highly flexible foldase chaperone domain which interacts with the lipase in a 1:1 stoichiometry. To determine whether the foldase was able to capture the emerging substrate at early translocation steps, N- and C-terminal truncations of LipA were created and used for interaction studies. Binding of the foldase to the C-terminal but not to the N-terminal truncation of the lipase was observed, suggesting that the foldase recognizes the C-terminally truncated lipase that mimics a translocation intermediate, whereby the lack of the N-terminus corrupts the interactions. Additionally, the foldase LipHFL was co-expressed with the translocon SecYEG and native membrane vesicles were utilized for preliminary in vitro transport studies of proLipA to check if LipH is involved in lipase translocation. Since the lipase A requires folding assistance and is highly prone to aggregation, the interactions with prominent periplasmic chaperones FkpA, SurA, Skp, YfgM and PpiD were investigated to check whether these proteins are involved in lipase biogenesis. The results indicated that the soluble periplasmic chaperone Skp prevents misfolding of the lipase in vitro and is crucial for lipase secretion as shown by in vivo analysis. The trimeric structure of P. aeruginosa Skp has been elucidated by small-angle X-ray scattering, identifying the open and closed conformation of the chaperone. Further interaction studies indicated two binding modes for LipA:Skp interactions with a 1:1 and 1:2 stoichiometry possessing binding affinities of 20 nM and 2 µM, respectively. Skp stabilizes the lipase via apolar interactions which are not affected by elevated ionic strengths. Therefore, Skp is a potent mediator upon lipase biogenesis that prevents aggregation, supports stabilization and the passage of unfolded LipA to LipH. Further structural investigations of the periplasmic chaperones were conducted and can further serve for more nuanced interaction studies with additional virulence factors. The present work forms the basis for further investigations in aim to elucidate the biogenesis of secretory proteins serving as virulence factors of gram-negative bacterial pathogens.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	12.12.2023
Dateien geändert am:	12.12.2023
Promotionsantrag am:	21.09.2023
Datum der Promotion:	05.12.2023