Dokument: Analysis of the signal transduction cascade tuning the 2-oxoglutarate dehydrogenase activity in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Analysis of the signal transduction cascade tuning the 2-oxoglutarate dehydrogenase activity in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64138
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20231117-084335-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Sundermeyer, Lea [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 52,07 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 13.11.2023 / geändert 13.11.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Lutz Schmitt [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In Corynebacterium glutamicum und vielen anderen Actinobakterien unterscheidet sich der 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex (ODH), ein Schlüsselenzym des Tricarbonsäurezyklus, von bekannten Vertretern durch eine ungewöhnliche E1-Untereinheit (OdhA), die mit der normalerweise in einer separaten E2o-Untereinheit vorliegenden Succinyltransferase-Domäne fusioniert ist. Daher benötigt OdhA die Lipoylgruppen des E2p-Proteins (AceF) des Pyruvat-Dehydrogenase-Komplexes (PDH) für die Übertragung der Succinylgruppe auf Coenzym A. Infolgedessen bildet ODH einen Hybridkomplex mit PDH, der aus den vier Proteinen OdhA, AceE (E1p), AceF und Lpd (E3) besteht. Eine weitere Besonderheit der ODH in C. glutamicum und anderen Actinobakterien ist ihre Regulierung durch das 15-kDa-Protein OdhI, das eine FHA-Domäne (forkhead-associated) enthält, von der bekannt ist, dass sie Phosphothreonin-Epitope bindet. In seinem unphosphorylierten Zustand bindet OdhI mit nM Affinität an OdhA und hemmt die ODH-Aktivität. Die Phosphorylierung von OdhI durch die lösliche Serin/Threonin-Proteinkinase PknG löst eine Konformationsänderung von OdhI aus, die seine Interaktion mit OdhA verhindert und dadurch die Hemmung der ODH-Aktivität aufhebt. Die Dephosphorylierung von phosphoryliertem OdhI wird durch die Phospho-Serin/Threonin-Proteinphosphatase Ppp katalysiert. Frühere Studien legten nahe, dass die Aktivität von PknG durch das periplasmatische Bindeprotein GlnH und das Transmembranprotein GlnX kontrolliert wird, deren Gene ein Opreon mit pknG bilden. Der Hauptteil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Charakterisierung von GlnH und GlnX. Durch isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) mit gereinigtem GlnH-Protein wurden L-Aspartat und L-Glutamat als Liganden identifiziert, die mit hoher μM- bis niedriger mM-Affinität gebunden werden. Für das GlnH-Homolog von Mycobacterium tuberculosis wurden wesentlich höhere Affinitäten im niedrigen μM-Bereich berichtet, was die Frage nach dem Grund für diesen großen Unterschied aufkommen ließ. Der Vergleich eines Strukturmodells von C. glutamicum GlnH mit der Kristallstruktur von M. tuberculosis GlnH ermöglichte die Identifizierung von Unterschieden in der Ligandenbindungsstelle. Die Bedeutung von zwei der identifizierten Aminosäurereste für die Bindungsaffinität wurde bestätigt, indem gezeigt wurde, dass ihr Austausch in C. glutamicum GlnH gegen die entsprechenden Reste von M. tuberculosis GlnH eine bis zu 6-fache Erhöhung der Bindungsaffinität für L-Aspartat und L-Glutamat bewirkt. In diesem Fall wurden Affinitäten durch Veränderungen der intrinsischen Tryptophanfluoreszenz bestimmt. Die Topologie des Membranproteins GlnX wurde mittels mehrerer GlnX-Varianten analysiert, die entweder mit alkalischer Phosphatase oder β-Galactosidase als Marker für eine periplasmatische bzw. cytoplasmatische Lokalisation fusioniert waren. Die Ergebnisse bestätigten die vorhergesagte Topologie mit N- und C-Terminus im Zytoplasma, vier Transmembranhelices und zwei großen periplasmatischen Domänen. Zusammen mit einem von Kooperationspartnern erstellten GlnX-Strukturmodell deuten die Ergebnisse darauf hin, dass PknG aktiviert wird, wenn GlnH externes L-Aspartat oder L-Glutamat detektiert und diese Information über GlnX an PknG weitergibt. GlnX sollte dabei im Periplasma mit GlnH und im Zytoplasma mit PknG interagieren. Aktives PknG hebt die Hemmung der ODH-Aktivität durch Phosphorylierung von OdhI auf. Auf diese Weise kann der Kohlenstofffluss am 2-Oxoglutarat-Knotenpunkt an die Anwesenheit der externen Aminodonatoren L-Aspartat und L-Glutamat angepasst werden. Neben der Charakterisierung der Proteine GlnH und GlnX wurde auch die intrazelluläre Lokalisation von OdhI durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen eines OdhI-mVenus-Fusionsproteins analysiert. Dabei zeigte sich, dass OdhI im Wildtyp in seiner unphosphorylierten Form an den Polen der Zelle bzw. in der Zellteilungsebene lokalisiert ist. Dagegen war das OdhI-mVenus-Protein in einem Stamm ohne die Phosphatase Ppp annähernd homogen im Cytoplasma verteilt. In diesem Stamm liegt OdhI nahezu vollständig phosphoryliert vor. Die Lokalisierungsergebnisse für OdhI wurden durch weitere Analysen bestätigt. Weiterhin wurde die Zusammensetzung und Aktivität des hybriden PDH-ODH-Komplexes durch Co-Reinigungsversuche und in vivo-Interaktionstests von OdhA-Varianten analysiert. In Corynebacterium glutamicum and many other actinobacteria, the 2-oxoglutarate dehydrogenase complex (ODH), a key enzyme of the tricarboxylic acid cycle, differs from well-known representatives by an unusual E1 subunit (OdhA), which is fused with the succinyltransferase domain usually present in a separate E2o subunit. Therefore, OdhA requires the lipoyl groups of the E2p protein (AceF) of the pyruvate dehydrogenase complex (PDH) for transferring the succinyl group to coenzyme A. As a consequence, ODH forms a hybrid complex with PDH, composed of the four proteins OdhA, AceE (E1p), AceF, and Lpd (E3). Another unusual feature of ODH in C. glutamicum and other actinobacteria is its regulation by the 15-kDa protein OdhI, which contains a forkhead-associated (FHA) domain known to bind phospho-threonine epitopes. In its unphosphorylated state, OdhI binds to OdhA with nM affinity and inhibits ODH activity. Phosphorylation of OdhI by the soluble serine/threonine protein kinase PknG triggers a conformational change of OdhI that prevents its interaction with OdhA and thereby abolishes the inhibition of ODH activity. Dephosphorylation of phosphorylated OdhI is catalyzed by the phospho-serine/threonine protein phosphatase Ppp. Previous studies suggested that PknG activity is controlled by the periplasmic binding protein GlnH and the transmembrane protein GlnX, whose genes form an operon with pknG. The major part of this thesis focused on the characterization of GlnH and GlnX. Isothermal titration calorimetry (ITC) with purified GlnH protein identified L-aspartate and L-glutamate as ligands bound with high μM to low mM affinity. For the GlnH homolog of Mycobacterium tuberculosis, much higher affinities in the low μM range were reported, triggering the question of the reason for this large difference. Comparison of a C. glutamicum GlnH structural model with the crystal structure of M. tuberculosis GlnH enabled the identification of differences in the ligand binding site. The relevance of two of the identified amino acid residues for the ligand binding affinity was confirmed by showing that their exchange in C. glutamicum GlnH to the corresponding residues in M. tuberculosis GlnH caused an up to a 6-fold increase in the binding affinity for L-aspartate and L-glutamate. In this case, the affinities were determined by measuring changes in the intrinsic tryptophan fluorescence. The topology of the membrane protein GlnX was analyzed using several GlnX variants fused with either alkaline phosphatase or β-galactosidase as markers for periplasmic and cytoplasmic localization. The results confirmed the predicted topology with N- and C-terminus located in the cytoplasm, four transmembrane helices, and two large periplasmic domains. Together with a GlnX structural model created by cooperation partners, these results suggested that PknG gets activated when GlnH senses external L-aspartate or L-glutamate and transmits this information to PknG via GlnX, which is assumed to interact in the periplasm with GlnH and in the cytoplasm with PknG. Active PknG relieves the inhibition of ODH activity by OdhI by phosphorylating OdhI. In this way, carbon flux at the 2-oxoglutarate node is adapted to the presence of the external amino donors L-aspartate and L-glutamate. In addition to characterizing the GlnH and GlnX proteins, the intracellular localization of OdhI was analyzed by fluorescence microscopy of an OdhI-mVenus fusion protein, which showed that OdhI in the wild type is localized in its unphosphorylated form at the poles of the cell or the cell division site. In contrast, OdhI-mVenus was almost homogeneously distributed in the cytoplasm in a strain lacking the phosphatase Ppp. In this strain, OdhI is almost completely phosphorylated. Additional analyses confirmed the localization results for OdhI. Furthermore, the composition and activity of the hybrid PDH-ODH complex were analyzed by co-purification experiments and in vivo interaction tests of OdhA variants.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	17.11.2023
Dateien geändert am:	17.11.2023
Promotionsantrag am:	28.09.2022
Datum der Promotion:	19.12.2022