Dokument: Synthese von sequenzdefinierten schirmartigen Glycooligomeren und Glycopolymeren zur Untersuchung an Langerin

Titel:	Synthese von sequenzdefinierten schirmartigen Glycooligomeren und Glycopolymeren zur Untersuchung an Langerin
Weiterer Titel:	Synthesis of sequence defined brush glycooligomers and glycopolymers targeting Langerin
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=64087
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20231110-100052-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Üclü, Serap [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.11.2023 / geändert 08.11.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Hartmann, Laura [Gutachter] Priv. Doz.. Dr. Klaus Schaper [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Oligo- und Polysaccharide wirken als Signal-, Erkennungs- und Adhäsionsmoleküle in biologischen Systemen und spielen eine entscheidende Rolle bei wichtigen biologischen Signaltransduktionsprozessen wie Wachstum und Zell-Zell-Erkennung, aber auch bei Wirt-Pathogen-Interaktionen. Da die Bindung einzelner Kohlenhydratbestandteile in der Regel schwach ist, nutzt die Natur die Multivalenz, d. h. die gleichzeitige Präsentation und Interaktion mehrerer Kohlenhydratmotive und ihrer jeweiligen Rezeptoren, um die Bindungsstärke zu erhöhen. Dieses Konzept wurde erfolgreich für die Entwicklung von Glycomimetika angepasst, bei denen mehrere Kohlenhydrateinheiten auf einem synthetischen Gerüst, z. B. einem Polymer oder einem Nanopartikel, präsentiert werden. Solche Glycomimetika sind vor allem als Modellsysteme von Bedeutung, um die biologische Funktion von Kohlenhydraten besser zu verstehen, haben aber auch bereits Anwendung in der Biomedizin gefunden, z. B. bei der Diagnose und Behandlung von Krebs oder der Bekämpfung von Infektionserregern. In dieser Arbeit wird ein besonderer Schwerpunkt auf die Entwicklung von Glycomimetika gelegt, die auf Langerin und DC-SIGN abzielen. Langerin und DC-SIGN sind C-Typ-Lektinrezeptoren, die auf dendritischen Zellen bzw. der Langerhans-Zell-Untergruppe exprimiert werden und durch die Regulierung der Immunantwort eine Schnittstelle zwischen dem angeborenen und dem adaptiven Immunsystem bilden. Obwohl beide Lektine viele Gemeinsamkeiten aufweisen, wie z. B. eine sich überschneidende Spezifität für Kohlenhydrate und eine ähnliche Rolle bei der Immunantwort, spielen Langerin und DC-SIGN bei der HIV-Infektion unterschiedliche Rollen. Während DC-SIGN die HIV-Übertragung fördert, sorgt Langerin für den HIV-Abbau durch die Bildung von Birbeck-Granula. Um diesen Mechanismus besser zu verstehen, ist die Entwicklung multivalenter Liganden mit hoher Affinität und Selektivität für Langerin besonders wichtig, da monovalente Kohlenhydratliganden eine geringe Affinität für Langerin aufweisen. In dieser Arbeit wurden zu diesem Zweck schirmartige Glykooligomere und Glykopolymere synthetisiert und auf ihre Bindung an Langerin untersucht. Die trimere Anordnung der kohlenhydraterkennenden Domänen wurde hier als Vorlage für einen neuartigen Baustein verwendet, der als TT-Linker bezeichnet wird, um schirmartige Glycooligomere zu schaffen, an die drei Kohlenhydratmotive in unmittelbarer Nähe angehängt werden können, ähnlich der natürlichen Darstellung in z. B. verzweigten Oligosacchariden. Diese schirmartigen Glykooligomere wurden mit anderen dreiwertigen verzweigten Liganden in einer Bindungsstudie an Langerin getestet. Zu diesem Zweck wurde mit Hilfe der Oberflächenplasmonenresonanz (SPR) ein Test auf Hemmungskonkurrenzen durchgeführt. Der Vergleich zwischen dem verzweigten Glykooligomer und dem schirmartigen Glykooligomer zeigte eine 7-fache Steigerung der Bindungsstärke gegenüber Langerin. Die Hinzufügung eines Schirmgriffs und die weitere Bindung von Mannoseeinheiten an diese Schirmstrukturen führte zu einer weiteren Steigerung der Affinität, die auf einen Clustereffekt zurückgeführt werden kann. Die Kammglykoligomere wurden dann an polymere Gerüste konjugiert, die Kammglykopolymere bilden. Auf diese Weise können mehrere Rezeptoren gleichzeitig angesprochen werden, was zu einer Clusterbildung führt, die für die Ausrichtung der von Langerin präsentierten Zelloberfläche wichtig ist. Es wurde eine Reihe von fluoreszenzmarkierten Kammglykopolymeren mit zunehmender Länge der Seitenkette hergestellt, die die Zugänglichkeit der dreiwertigen Mannose-Kopfgruppen variieren, und auf Langerin-exprimierende Zellen hin untersucht. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte eine Korrelation zwischen der Länge der Seitenkette und der Zellbindung, wobei das Glykopolymer mit der längsten Seitenkette die höchste Bindung aufwies. Als alternatives Gerüst und für die In-situ-Fluoreszenzmarkierung wurden Nanopartikel auf Kohlenstoffbasis auch mit Monosacchariden sowie schirmartige Glykoligomeren funktionalisiert und auf ihre Wechselwirkung mit verschiedenen Brustkrebszelllinien getestet, die bekanntermaßen kohlenhydraterkennende Lektinrezeptoren überexprimieren. Es wurde eine ähnliche interzelluläre Verteilung von nicht funktionalisierten und Glyco-CNPs beobachtet. Die mikroskopische Untersuchung zeigte, dass CNPs unabhängig von ihrer Funktionalisierung bevorzugt in den endolysosomalen Weg eingelagert werden. Generell verdeutlicht diese Arbeit die Schwierigkeiten bei dem Versuch, die rezeptorvermittelte Aufnahme von Glyko-CNPs über Kohlenhydrat erkennende Zelloberflächenrezeptoren zu erreichen, und unterstützt gleichzeitig die mögliche Verwendung von Glyko-CNPs in biomedizinischen Anwendungen. Als weiteres Partikelsystem wurden in dieser Arbeit kohlenhydratdekorierte Janus-Partikel verwendet, um das kohlenhydratvermittelte Adhäsionsverhalten von E. coli-Bakterien zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Janus-Partikel auf der einen Seite mit einem Schirm-Glykooligomer und auf der gegenüberliegenden Seite mit thermoresponsivem Poly(N-isopropylacrylamid) (PNIPAM) funktionalisiert. Dies ist das erste Mal, dass glykofunktionalisierte Janus-Partikel als Inhibitoren von E. coli gemeldet und getestet wurden. Mikroskopische Untersuchungen zeigten, dass die Glyko-Janus-Partikel eine haloartige Anordnung auf der Oberfläche von E. coli aufwiesen und zur Isolierung einzelner Bakterien führten, während die glykofunktionalisierten Partikel aufgrund ihrer einheitlichen Glykofunktionalisierung große Cluster mit den Bakterien bildeten. Darüber hinaus zeigten temperaturabhängige Experimente mit glykofunktionalisierten Janus-Partikeln und nicht-glykofunktionalisierten Janus-Partikeln eine Partikelaggregation oberhalb der LCST von PNIPAM. Insgesamt wird in dieser Arbeit ein Bottom-up-Ansatz für die Herstellung von Glycomimetika unterschiedlicher Bauart und Größe demonstriert, ausgehend von dem kleinsten, speziell für Langerin entwickelten Baustein TT-Linker und dessen Kombination mit verschiedenen Polymer- und Partikelgerüsten. Der Einsatz der verschiedenen Glykomimetika in verschiedenen biotechnologischen und biomedizinischen Anwendungen wurde demonstriert, z. B. für die gezielte Abgabe von Medikamenten, in der Immuntherapie oder als Marker für Tumorzellen. In Zukunft können weitere Glycomimetika mit diesem Bottom-up-Ansatz entwickelt werden, die auch auf andere kohlenhydratvermittelte Wechselwirkungen abzielen, z. B. durch die Verwendung des TT-Linkers für die Nahpräsentation mehrerer Sialinsäuren, Fucose oder sulfatierter Kohlenhydrate und die Ausrichtung auf virale Eintrittsrezeptoren, um Hemmstoffe für Virusinfektionen abzuleiten. Oligo- and polysaccharides act as signaling, recognition and adhesion molecules in biological systems and play a crucial role in important biological signal transduction processes such as growth and cell-cell recognition, but also host-pathogen interactions. Since the binding of single carbohydrate moieties is usually weak, Nature utilizes multivalency, the simultaneous presentation and interaction of multiple carbohydrate motifs and their respective receptors, to enhance the binding strength. This concept has been successfully adapted for the development of glycomimetics, where multiple carbohydrate units are presented on a synthetic scaffold, e.g., a polymer or a nanoparticle. Such glycomimetics are especially relevant as model systems to better understand the biological function of carbohydrates but have also already found application in biomedicine e.g., in diagnosing and treating cancer or the fight against pathogen infections. In this work, special focus is devoted to the development of glycomimetics targeting Langerin and DC-SIGN. Langerin and DC-SIGN are C-Typ lectin receptors expressed on dendritic cells and the Langerhans cell subset, respectively, and interface between the innate and adaptive immune systems by regulating the immune response. Although both lectins share many similarities, such as overlapping specificity for carbohydrates and similar roles in the immune response, Langerin and DC-SIGN play distinct roles in HIV infection. While DC-SIGN promotes HIV transmission, Langerin ensures HIV degradation through the formation of Birbeck granules. To better understand this mechanism, the development of multivalent ligands with high affinity and selectivity for Langerin is particularly important, as monovalent carbohydrate ligands have low affinity for Langerin. In this work, brush glycooligomers and glycopolymers were synthesized for this purpose and examined for their binding to Langerin. The trimeric arrangement of carbohydrate-recognizing domains was used here as a template for a novel building block, termed a TT linker, to create umbrella-like glycooligomers to which three carbohydrate motifs can be attached in close proximity, similar to the natural representation in, for example, branched oligosaccharides. These umbrella-like glycooligomers were tested with other trivalent branched ligands in a binding study to Langerin. For this purpose, an inhibition-competitions assay was established using surface plasmon resonance (SPR). The comparison between the branched glycooligomer and umbrella like glycooligomer showed a 7-fold increase of binding strength towards Langerin. The addition of an umbrella handle and further binding mannose units to these umbrella structures led to a further increase in affinity, which can be attributed to a clustering effect. The umbrella glycooligomers were then conjugated to polymeric scaffolds forming brush glycopolymers. This allows multiple receptors to be accessed simultaneously, resulting in clustering, which is important for targeting Langerin presented cell surface. A set of fluorescently labelled brush glycopolymers with increasing length of the side chain were prepared varying the accessibility of the trivalent mannose head groups and investigated towards Langerin-expressing cells. Flow cytometric analysis showed a correlation between side chain length and cellular binding, with the glycopolymer with the longest side chain length showing the highest binding. As alternative scaffold and for in situ fluorescent labelling, carbon-based nanoparticles were also functionalized with monosaccharides as well as brush glycooligomers and tested for their interaction with various breast cancer cell lines known to overexpress carbohydrate-recognizing lectin receptors. Similar intercellular distribution of nonfunctionalized and glyco-CNPs was observed. Microscopic examination showed that CNPs are preferentially stored in the endolysosomal pathway regardless of their functionalization. In general, this work highlights the difficulties in attempting to accomplish receptor-mediated uptake of glyco-CNPs via carbohydrate-recognizing cell surface receptors while also supporting the possible use of glyco-CNPs in biomedical applications. As another particle system, carbohydrate-decorated Janus particles were used in this work to study the carbohydrate-mediated adhesion behavior of E. coli bacteria. For this purpose, Janus particles were functionalized with umbrella glycooligomer on the one side and thermoresponsive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) on the opposite side. This is the first time that glyco-functionalized Janus particles have been reported and tested as inhibitors of E. coli. Microscopic studies showed that while glyco-Janus particles exhibited a halo-like arrangement on the surface of E. coli and led to the isolation of individual bacteria, the glyco-functionalized particles formed large clusters with the bacteria due to their uniform glyco-functionalization. Furthermore, temperature-dependent experiments with glycofunctionalized Janus particles and non-glycofunctionalized Janus particles showed particle aggregation above the LCST of PNIPAM. Overall, this thesis demonstrates a bottom-up approach for the preparation of glycomimetics of various designs and sizes, starting from the smallest building block TT-linker specifically designed for Langerin and combining it with various polymeric and particle scaffolds. Use of the different glycomimetics in various biotechnological and biomedical applications was demonstrated, e.g. for targeted drug delivery, in immunotherapy or as markers for tumor cells. In the future, further glycomimetics can be designed by this bottom-up approach targeting also other carbohydrate-mediated interactions e.g., by using the TT-linker for the close-proximity presentation of multiple sialic acids, fucose or sulphated carbohydrate and targeting viral entry receptors to derive inhibitors of viral infections.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Organische Chemie und Makromolekulare Chemie
Dokument erstellt am:	10.11.2023
Dateien geändert am:	10.11.2023
Promotionsantrag am:	13.06.2023
Datum der Promotion:	26.10.2023