Dokument: Phylogenetic survey of the subtilase family and biochemical characterisation of novel subtilisins derived from halotolerant or halophilic Bacillaceae

Titel:	Phylogenetic survey of the subtilase family and biochemical characterisation of novel subtilisins derived from halotolerant or halophilic Bacillaceae
Weiterer Titel:	Phylogenetische Untersuchung der Subtilase-Familie und biochemische Charakterisierung neuer Subtilisine aus halotoleranten oder halophilen Bacillaceae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63949
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20231106-131650-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Falkenberg, Fabian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 36,19 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.10.2023 / geändert 24.10.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Dr. Bongaerts, Johannes [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The increasing demand for proteases for industrial applications in various fields such as detergents, cosmetics, leather processing, waste water treatment and pharmaceuticals with ever new requirements for the proteases necessitates the need for new proteases with improved properties. To meet this demand, new protease candidates were searched for in this work in the group of subtilisins, which belong to the subtilases. First, the sequences of already characterised proteases from the subtilase family were collected and re-evaluated with regard to their classification, since the number of newly characterised subtilases is constantly increasing and the overview of this large family has not been updated since 1997 (Siezen and Leunissen). The phylogenetic analysis of the MEROPS holotype data set of the subtilase family revealed that a large number of different subtilases form new groups and subgroups. Eight new groups and 13 new subgroups were identified and introduced. Furthermore, an updated overview was necessary to be able to assign newly found sequences phylogenetically to the already known ones. Thus, in a database-based search for new subtilisin sequences from the family Bacillaceae, about 1400 sequences were evaluated. Using the updated phylogenetic context and further bioinformatic analysis, a group of 120 sequences was identified and selected for further analysis. In particular, enzymes from halophilic or halotolerant organisms offer enormous potential for meeting industrial requirements. Therefore, the subtilisin genes from Pontibacillus marinus DSM 16465T (SPPM), Metabacillus indicus DSM 16189 (SPMI), Litchfieldia alkalitelluris DSM 16976T (SPLA), Fictibacillus arsenicus DSM 15822T (SPFA), Alkalibacillus haloalkaliphilus DSM 5271T (SPAH) and Halalkalibacter okhensis Kh10-101T (SPAO) were isolated and the enzymes recombinantly produced with Bacillus subtilis DB104, then purified and biochemically characterised. Here it could be confirmed that the wild-type subtilisins from halotolerant and halophilic species had technically more interesting biochemical properties than the previously developed high-alkaline subtilisins. Especially worth mentioning is the high stability towards SDS, NaCl, H2O2, as well as the high activity at alkaline pH, which is interesting for both research and industrial applications. In addition, the organisms mentioned above were investigated for their genetic accessibility. Here, Metabacillus indicus DSM 16189 was established as a new host and used for the recombinant production of its own secreted subtilisin. By studying novel subtilisins with halotolerant and halophilic origins, this work contributes to the understanding of the adaptation of extracellular enzymes and the relationship between amino acid sequence and biochemical properties. The results, especially from structure-function analysis with emphasis on surface charge analysis, form the starting point for further enzyme engineering studies. Die steigende Nachfrage nach Proteasen für die industrielle Anwendung in verschiedenen Bereichen wie Waschmittel, Kosmetika, Lederverarbeitung, Abwasserbehandlung und Pharmazeutik mit immer neuen Anforderungen an die Eigenschaften von Proteasen zeigt die Notwendigkeit des Bedarfes an neuen Proteasen mit verbesserten Eigenschaften. Um diesem Bedarf gerecht zu werden, wurden in dieser Arbeit neue Protease-Kandidaten aus der Gruppe der Subtilisine, die zu den Subtilasen gehören, identifiziert. Zunächst wurden die Sequenzen bereits charakterisierter Proteasen aus der Subtilase-Familie untersucht und hinsichtlich ihrer Klassifizierung neu bewertet, da eine Übersicht über diese große Familie seit 1997 (Siezen und Leunissen) nicht mehr aktualisiert wurde und die Zahl der neu charakterisierten Subtilasen stetig zunimmt. Die phylogenetische Analyse des MEROPS-Holotyp-Datensatzes der Subtilase-Familie ergab, dass eine große Anzahl verschiedener Subtilasen neue Gruppen und Untergruppen bilden. Es wurden acht neue Gruppen und 13 neue Untergruppen identifiziert und eingeführt. Darüber hinaus wurde eine aktualisierte Übersicht erstellt, um die neu gefundenen Sequenzen phylogenetisch den bereits bekannten zuordnen zu können. So wurden in einer datenbankbasierten Suche nach neuen Subtilisin-Sequenzen aus der Familie der Bacillaceae rund 1400 Sequenzen ausgewertet. Unter Verwendung des aktualisierten phylogenetischen Kontextes und weiterer bioinformatischer Analysen konnte eine Gruppe von 120 Sequenzen identifiziert werden, die für weitere Untersuchungen ausgewählt wurden. Insbesondere Enzyme aus halophilen oder halotoleranten Organismen bieten ein enormes Potenzial, um industrielle Anforderungen zu erfüllen. Daher wurden die Subtilisin-Gene von Pontibacillus marinus DSM 16465T (SPPM), Metabacillus indicus DSM 16189 (SPMI), Litchfieldia alkalitelluris DSM 16976T (SPLA), Fictibacillus arsenicus DSM 15822T (SPFA), Alkalibacillus haloalkaliphilus DSM 5271T (SPAH) und Halalkalibacter okhensis Kh10-101T (SPAO) isoliert und die Enzyme rekombinant mit Bacillus subtilis DB104 produziert, anschließend gereinigt und biochemisch charakterisiert. Dabei konnte bestätigt werden, dass die Wildtyp-Subtilisine aus halotoleranten und halophilen Spezies technisch interessantere biochemische Eigenschaften aufweisen als die für die technische Anwendung entwickelten hochalkalischen Subtilisine. Besonders erwähnenswert ist die hohe Stabilität gegenüber SDS, NaCl und H2O2 sowie die hohe Aktivität bei alkalischen pH-Werten, die sowohl wissenschaftlich als auch für industrielle Anwendungen interessant ist. Darüber hinaus wurden die oben genannten Organismen auf ihre genetische Zugänglichkeit hin untersucht. Dabei konnte Metabacillus indicus DSM 16189 als neuer Wirt etabliert und für die rekombinante Produktion des nativen sekretierten Subtilisins genutzt werden. Die Untersuchung neuer Subtilisine mit halotolerantem und halophilem Ursprung in dieser Arbeit trägt zum Verständnis der Anpassung extrazellulärer Enzyme und der Beziehung zwischen Aminosäuresequenz und biochemischen Eigenschaften bei. Die gewonnenen Erkenntnisse, insbesondere aus der Struktur-Funktions-Analyse mit Schwerpunkt auf der Oberflächenladungsanalyse, bilden den Ausgangspunkt für weitere enzymtechnische Studien.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	06.11.2023
Dateien geändert am:	06.11.2023
Promotionsantrag am:	21.06.2023
Datum der Promotion:	20.10.2023