Dokument: Modulation der spontanen sowie TGF-β-induzierten Differenzierung von Morbus-Dupuytren-Fibroblasten zu Myofibroblasten durch Vitamin D
| Titel: | Modulation der spontanen sowie TGF-β-induzierten Differenzierung von Morbus-Dupuytren-Fibroblasten zu Myofibroblasten durch Vitamin D | |||||||
| Weiterer Titel: | Modulation of spontaneous as well as TGF-β-induced differentiation of Dupuytren's disease fibroblasts to myofibroblasts by vitamin D | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63788 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20231002-112924-8 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Zader, Torben [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Suschek, Christoph V. [Gutachter] PD Dr. Mahotka, Csaba [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Hintergrund:
Morbus Dupuytren (MD) bzw. die Dupuytren-Kontraktur ist eine fibrosierende Bindegewebserkrankung der Palmaraponeurose. Hierbei kommt es zu Verknotungen und Verkürzungen des Bindegewebes an der Handinnenfläche und als Folge zu einer eingeschränkten Streckbarkeit einzelner oder mehrerer Finger. Von zentraler Bedeutung bei der Entstehung der Erkrankung sind nach heutiger Ansicht Myofibroblasten. Es konnte mehrfach gezeigt werden, dass sich in früheren Erkrankungsstadien vermehrt Fibroblasten zu Myofibroblasten differenzieren. Transforming growth factor beta (TGF-β) ist einer der Hauptinduktoren dieser Differenzierung. Jüngere Untersuchungen haben gezeigt, dass Vitamin D über den Vitamin-D-Rezeptor (VDR) den TGF-β-Signalweg zu hemmen vermag. Diese Arbeit hatte zum Ziel, eine mögliche Beeinflussung des TGF-β-Signalweges durch Vitamin D in vitro an Fibroblasten zu untersuchen. Außerdem von Interesse war, ob sich ein Unterschied in der Reaktion von Fibroblasten von Dupuytren-Patienten gegenüber entsprechenden Kontrollen (Fibroblasten von Karpaltunnelsyndrom-Patienten) nachweisen lässt. Hypothesen: Vitamin D3 (Calcitriol) führt in Fibroblasten zu einer (Teil-)Revision der TGF-β vermittelt erhöhten alpha smooth muscle actin (α-SMA) Expression. Zudem werden Proteine im TGF-β-Signalweg gehemmt oder hemmende Einflüsse hochreguliert. Calcitriol hemmt die Translokation von phosphorylierten SMAD-Komplexen in den Zellkern und hemmt somit die Fibroblastendifferenzierung zu Myofibroblasten. Methoden: Es wurden Fibroblastenzellkulturen aus intraoperativ entnommenen Gewebeproben der Palmaraponeurose von Dupuytren-Patienten gewonnen (MD-Gruppe). Als Vergleichsgruppe wurden Zellkulturen aus intraoperativ gewonnenen Proben des Retinaculum flexorum von Karpaltunnelsyndrom-Patienten herangezogen (CTS-Gruppe). Die Zellkulturen wurden für drei Tage verschiedenen Dosen von Calcitriol und/oder TGF-β ausgesetzt. Anschließend erfolgte eine semiquantitative Analyse der Expression von folgenden Proteinen der TGF-β Signalkette: VDR, SMAD4, SMAD7, pSMAD2, sowie α-SMA. Zur Analyse wurden Western Blots mit anschließender Immunfärbung angewandt. Bei weiteren Versuchen wurde das Zelllysat vor Analyse mittels eines Kits der Firma Thermo Fisher Scientific in eine zytoplasmatische und eine nukleäre Fraktion aufgetrennt. Ergebnisse: Unbehandelte Zellen von Dupuytren-Patienten zeigten eine signifikant höhere α-SMA Expression gegenüber solchen von Karpaltunnelsyndrom-Patienten. Von den untersuchten Zellproteinen zeigte der VDR unter Calcitriol-Einfluss eine signifikante Dynamik. Mit steigender Calcitriol-Konzentration stieg die Menge an VDR in beiden Gruppen an. Die Signalproteine SMAD4, SMAD7, pSMAD2 und α-SMA wurden in ihrem Expressionslevel nicht signifikant beeinflusst. Unter simultanem TGF-β Einfluss zeigte pSMAD2 eine signifikante Dynamik. Bei steigender Calcitriol-Konzentration konnte ein Abfall der Proteinexpression von pSMAD2 beobachtet werden, das als Signalprotein die Myofibrogenese steigert. Dieser Zusammenhang zeigte sich sowohl in der MD-, als auch in der CTS-Gruppe, war jedoch nur in der CTS-Gruppe statistisch signifikant. Das α-SMA Expressionslevel zeigte hier vor allem in der MD-Gruppe zwar ähnliche, aber keine signifikanten Tendenzen. Ein punktueller Vergleich von ausschließlich mit Calcitriol und Calcitriol+TGF-β behandelten Zellen bestätigte in beiden Gruppen, dass die Behandlung mit TGF-β zu einem Anstieg der α-SMA Expression führte, wohingegen kein Expressionsanstieg der Signalproteine (SMAD4, SMAD7, pSMAD2) nachgewiesen werden konnte. In den abschließenden Versuchen zeigte sich ein signifikanter Abfall der zytoplasmatischen SMAD4 Expression in den mit Calcitriol und TGF-β behandelten Zellen der MD-Gruppe. Weitere Dynamiken der zytoplasmatischen oder nukleären SMAD4 Expression waren nicht erkennbar. Schlussfolgerungen: Unbehandelte Fibroblastenzellkulturen aus Morbus Dupuytren Gewebe zeigen eine deutlich höhere α-SMA Expression gegenüber solchen der Kontrollgruppe. Als Kontrolle des Behandlungserfolgs mit Calcitriol wurde die Expression des VDR herangezogen. Hier zeigte sich statistische Evidenz für einen Effekt der Behandlung mit Calcitriol. Darüber hinaus konnten mit den gewählten Testparametern (Dauer/Menge/Sequenz der Vitamin-D-/ TGF-β-Behandlung) keine Effekte auf Signalproteine oder α-SMA-Konzentration nachgewiesen werden. Die erarbeiteten Ergebnisse zeigen, dass Vitamin D durchaus in der Lage ist, die TGF-β-induzierte Signaltransduktion zu modulieren, jedoch ohne einen signifikanten Einfluss auf die Myofibrogenese der hier untersuchten Fibroblastenzellkulturen.Background: Dupuytren's contracture (MD) is a fibroproliferative disease of the palmar aponeurosis. Connective tissue on the palm of the hand shrinkens and forms nodules which leads to one or more fingers becoming permanently bent in a flexed position. According to today's state of knowledge, myofibroblasts play a central role in the formation of the disease. Research has repeatedly shown that in early stages of disease fibroblasts increasingly differentiate into myofibroblasts. TGF-β is one of the main drivers of this process. Recent investigations have uncovered a way for vitamin D to inhibit TGF-β signaling via the vitamin D receptor (VDR). This work aimed to study possible interactions between vitamin D and the TGF-β signaling pathway in fibroblasts in vitro. In addition, the question was examined if fibroblasts from dupuytren’s patients behave different than those of people without MD. Hypotheses: Vitamin D3 (calcitriol) leads to a (partial) reversal of the TGF-β-mediated increase in alpha smooth muscle actin (α-SMA) expression. Proteins of the TGF-β signaling pathway are either being inhibited or inhibiting factors upregulated. Calcitriol inhibits translocation of phosphorylated SMAD-complexes and thus the differentiation of fibroblasts to myobroblasts. Methods: Fibroblast cell cultures were grown from explants obtained from patients undergoing surgery for Dupuytren’s contracture (MD group). As controls explants of the transverse carpal ligament obtained from patients undergoing surgery for carpal tunnel syndrome were used (CTS group). The cells were exposed to different dosages of Calcitriol and/or TGF-β and subsequently subject to a semi-quantitative analysis of the following proteins of the TGF-β signaling pathway: VDR, SMAD4, SMAD7, pSMAD2, and α-SMA. For the analysis western blotting followed by immunostaining was used. Later experiments used a cell separator kit from Thermo Fischer Scientific to sort the cell lysate into a cytoplasmatic and a nuclear fraction prior to analysis. Results: Untreated cells from Dupuytren’s patients had significantly higher α-SMA expression than those from carpal tunnel syndrome patients. Of the examined proteins VDR showed a significant change of expression level under treatment with calcitriol. Higher concentrations of calcitriol lead to a higher expression of VDR in both the MD and the CTS group. The signaling proteins SMAD4, SMAD7, pSMAD2 and α-SMA were not significantly altered in their level of expression. Under simultaneous treatment with TGF-β pSMAD2 showed a significant dynamic. Higher concentrations of calcitriol lead to a decrease in the expression the profibrotic signaling protein pSMAD2. This was observed both in the MD and the CTS group while only being statistically significant in the CTS group. α-SMA expression showed similar, despite not significant tendencies, especially in the MD group. Selective comparisons of cells treated with calcitriol alone vs. calcitriol+TGF-β confirmed TGF-β treatment leading to an increase in α-SMA expression in both groups while not showing changes in the levels of expression of signaling proteins (SMAD4, SMAD7, pSMAD2). Final experiments showed a significant decrease of cytoplasmatic SMAD4 expression in calcitriol/TGF-β co-treated cells of the MD group. Other dynamics of cytoplasmatic or nuclear SMAD4 expression were not observed. Conclusions: Untreated fibroblast cell cultures derived from Dupuytren’s contracture tissue show a significantly higher level of α-SMA expression than the control group. Increased expression of the VDR was used as an indicator of successful calcitriol treatment. A statistically significant effect could be shown here. Beyond that no effects could be shown using the chosen parameters of the experiments (duration/amount/sequence of the vitamin D/ TGF-β treatment). The acquired results demonstrate that vitamin D is indeed capable of modulating TGF-β signaling but without significant effect on the myofibrogenesis of the fibroblast cell cultures studied here. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 02.10.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 02.10.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.04.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.09.2023 |
