Dokument: Biosynthesis of lignans in plant species of the section Linum: pinoresinol-lariciresinol reductase and justicidin B 7-hydroxylase

Titel:	Biosynthesis of lignans in plant species of the section Linum: pinoresinol-lariciresinol reductase and justicidin B 7-hydroxylase
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=6377
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20071121-103327-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hemmati, Shiva [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,60 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.11.2007 / geändert 20.11.2007
Beitragende:	Prof. Dr. Alfermann, AW [Gutachter] Prof. Dr. Li, Shu Ming [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Lignane sind Dimere aus zwei Phenylpropanmolekülen, die jeweils über ihre 8-8′ Kohlenstoffatome der Seitenketten miteinander verknüpft sind. Linum usitatissimum und Linum perenne H, zwei Arten der Sektion Linum (Linaceae) akkumulieren hauptsächlich Lignane vom Typ der Dibenzylbutane [Secoisolariciresinol (Seco)] beziehungsweise Aryl¬naph¬¬thalene [Justicidin B (Jus B) oder Diphyllin (Diph)]. Seco schützt vor Hormon-abhän¬gigen Krebsarten. Jus B zeigt Cytotoxicität gegen chronische Leukämie. Die ersten Schritte der Biosynthese verschiedenster Lignane sollen gleich sein. Die Kopplung von zwei Molekülen Coniferylalkohol liefert Pinoresinol, welches von der Pinoresinol-Larici¬re¬sinol-Reduktase (PLR) über Lariciresinol (Lari) zu Secoisolariciresinol (Seco) reduziert wird. Seco wird zu Matairesinol, dem vermutlich zentralen Intermediat der Lignan¬bio¬syn¬these, umgesetzt. Da zu Beginn der vorliegenden Arbeit nichts zu Biosynthese der Arylnaphthalen-Lignane bekannt war, wurde hier ein Biosyntheseweg für JusB und Diph vorgeschlagen. Als erstes wurde eine cDNA für eine PLR (PLR-Lp1) aus Zellkulturen von L. perenne kloniert. „Hairy Root“-Linien, die zur Suppression der PLR-Lp1 Genexpression mit ihpRNAi Konstrukten transformiert waren, zeigten geringere Akkumulation des PLR-Lp1-Gens, so wie reduzierte PLR-Enzymaktivität. Die Akkumulation von JusB war auf 24 % im Vergleich zu Kontroll¬linien abgesenkt. Diese Ergebnisse beweisen, dass die PLR an der Biosynthese des JusB beteiligt ist. Als zweites Enzym aus dem vorgeschlagenen Biosyntheseweg wurde die JusB-7-Hydroxylase (JusB7H) in Mikrosomen von Zellkulturen von L. perenne charakterisiert. Versuche mit Inhibitoren für Cytochrom P450 Monooxygenasen (Cytochrom c und Clotri¬mazol) zeigen, dass die Hydroxylierung des Jus B zu Diph an Position 7 von einer Cyto¬chrom P450 Monooxygenase katalysiert wird. Die JusB7H hat ein pH-Optimum von ca. 7.4 und ein Tem¬pe¬raturoptimum um 26 °C. Jus B wurde als einziges der getesteten Substrate akzeptiert mit einem apparenten Km von 3.9 ± 1.3 µM. NADPH ist der vorherrschende Elektronendonor. NADH ist ein nur schwaches Cosubstrat. Der apparente Km für NADPH ist 102 ± 10 µM. Die meisten in der Natur gefundenen Lignane sind optisch aktiv, wobei sie entweder als einzelnes Enantiomer oder Mischungen von Enantiomeren in variabler Zusammensetzung vorkommen. Enantiomerenreinheit scheint während der ersten Schritte der Biosynthese auf verschiedenen Ebenen festgelegt zu werden. In Samen von L. usitatissimum liegt zu 99 % (+)-Secoisolariciresinoldiglucosid, aber zu 1% auch das andere Enantiomer vor. In blühenden Pflanzen von L. usitatissimum kommen nur die (-)-Enantiomere von Lignanen vor. Eine rekom¬binante PLR (PLR-Lu1) aus L. usitatissimum Samen ist spezifisch für die Umwandlung von (-)-Pino zu (+)-Seco. Im Zuge dieser Arbeit wurde eine zweite cDNA für eine PLR (PLR-Lu2) aus Blättern von L. usitatissimum isoliert. Das heterolog exprimierte und gereinigte Protein ist enantiospezifisch für die Umwandlung von (+)-Pino zu (-)-Seco. Der Vergleich der Expressionsmuster der beiden PLRs ergab, dass die PLR-Lu1 in sich entwickelnden Samen und Wurzeln, nicht aber Blättern und Stängeln exprimiert wird. Die Transkripte der PLR-Lu2 wurden in allen untersuchten Organen besonders zahlreich aber in Blättern nachgewiesen. Daraus ist zu schließen, dass die enantiomere Zusammensetzung der Lignane in den Organen von L. usitatissimum durch das Wechselspiel von PLR-Lu1 und PLR-Lu2 bestimmt wird und nicht durch das Vorhandensein einer mehr oder weniger enantio¬unspezifischen PLR. Im Gegensatz dazu stehen die Befunde zur Enantiospezifität der PLR aus L. perenne, PLR-Lp1. Das heterolog exprimierte Protein bevorzugt im ersten Reak¬tions¬schritt (+)-Pino, im zweiten aber (-)-Lari. Damit ist zum ersten Mal eine PLR kloniert worden, die in den beiden Reaktionschritten entgegengesetzte Enantioselektivität zeigt. Lignans are a class of secondary metabolites derived from two phenylpropanoid units that are linked by a C-C bond between 8 and 8′ of the side chain carbon atoms. Linum usitatissimum and Linum perenne H, two species of the section Linum of the Linaceae mainly accumulate dibenzylbutan [secoisolariciresinol (Seco)] and arylnaphthalene [justicidin B (Jus B) or diphyllin (Diph)] type lignans, respectively. Seco reduces the incidence of hormone dependent cancers. Jus B shows cytotoxicity against chronic leukemias. The first steps in the biosynthesis of lignans are discussed to be ubiquitous leading to all kind of structures. The coupling of two molecules of coniferyl alcohol yields pinoresinol (Pino) which is reduced by the pinoresinol-lariciresinol reductase (PLR) via lariciresinol (Lari) to Secoiso¬lariciresinol (Seco). Seco is converted to matairesinol the predicted central intermediate in lignan biosynthesis. Since nothing was known about the biosynthesis of arylnaphthalene lignans, a pathway for the biosynthesis of arylnaphthalene lignans like Jus B and Diph, based on the lignan structures found in L. perenne was proposed. Firstly, a cDNA encoding a PLR (PLR-Lp1) from a cell culture of L. perenne was cloned. Hairy root lines which were transformed with an ihpRNAi construct to suppress PLR-Lp1 gene expression show less mRNA accumulation for the PLR-Lp1 gene and PLR enzyme activity. Jus B accumulation was reduced to 24% in comparison to control lines. These results prove the involvement of PLR in the biosynthesis of arylnaphthalene lignans. As a second enzyme of the proposed pathway, Justicidin B 7-hydroxylase (JusB7H) was characterized from a microsomal fraction prepared from a L. perenne H suspension culture. The enzyme catalyzes the last step in the biosynthesis of Diph by introducing a hydroxyl group in position 7 of Jus B. The hydroxylase activity was strongly inhibited by cytochrome c as well as other cytochrome P450 inhibitors like clotrimazole indicating the involvement of a cytochrome P450-dependent monooxygenase. JusB7H has a pH optimum of 7.4 and a temperature optimum of 26 °C. Jus B was the only substrate accepted by JusB7H with an apparent Km of 3.9 ± 1.3 µM. NADPH is predominantly accepted as the electron donor, but NADH was a weak cosubstrate. A synergistic effect of NADPH and NADH was not observed. The apparent Km for NADPH was 102 ± 10 µM. Most isolated naturally occurring lignans are optically active as a single enantiomer or mixtures with various enantiomeric compositions. Enantiomeric purity in lignan biosynthesis is determined during the first steps, but on different levels. Seeds of Linum usitatissimum contain almost 99% (+)- and 1% (-)-Seco-diglucoside. Aerial parts of L. usitatissimum accumulate only the (-)-enantiomers of lignans which should be derivatives of (-)-Seco. A recombinant PLR (PLR-Lu1) from L. usitatissimum seeds converts only (-)-pinoresinol (Pino) to (+)-Seco. A second cDNA PLR-Lu2 from the leaves of L. usitatissimum was isolated during this work. The recombinant protein converts only (+)-Pino to (-)-Seco. Expression profiling of both PLRs revealed that PLR-Lu1 was strongly expressed in seeds as well as roots whereas in leaves and stems its expression was absent. PLR-Lu2 was expressed in all tested organs with the strongest signal in leaves. Therefore, the enantiomeric composition of lignans in the organs of L. usitatissimum is determined by the relative action of two PLRs with opposite enantiospecificity rather than a single enzyme with low enantiospecificity. In contrast, experiments with the recombinant PLR of L. perenne, PLR-Lp1, revealed that it prefers (+)-Pino in the first reaction step, but (-)-Lari in the second step. It is the first PLR described with opposite enantiospecificity within the two reaction steps catalyzed by PLRs.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Entwicklungs- und Molekularbiologie der Pflanzen
Dokument erstellt am:	20.11.2007
Dateien geändert am:	20.11.2007
Promotionsantrag am:	19.10.2007
Datum der Promotion:	19.11.2007