Dokument: Structure and Function of the Ca2+ dependent K+ channel AKT1 from A. thaliana

Titel:	Structure and Function of the Ca2+ dependent K+ channel AKT1 from A. thaliana
Weiterer Titel:	Struktur und Funktion des Ca2+ abhängigen K+ Kanals AKT1 aus A. thaliana
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63745
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20231005-112701-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Bork, Alexandra [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,88 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.09.2023 / geändert 25.09.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Stichwörter:	Biochemistry
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Pflanzen spielen eine essentielle Rolle für alle Lebewesen auf der Erde, sei es durch die Fixierung von CO2 oder als Nahrungsquelle. Daher ist es von großem Interesse die Pflanzen selbst und ihre Ernährung zu verstehen. Wenn ein Nährstoff im Boden zur Neige geht, müssen Pflanzen als sesshafte Organismen sich an diese Veränderungen anpassen. Diese Arbeit konzentrierte sich auf ein Membranprotein aus der Modellpflanze Arabidopsis thaliana, welches an der K+-Aufnahme unter niedrigen K+-Bedingungen im Boden beteiligt ist, nämlich den spannungsgesteuerten K+-Kanal AKT1. Durch in planta und Xenopus Oozyten Experimente wurden die Proteinkinase CIPK23 und die Plasmamembran-assoziierten Ca2+-Sensorproteine CBL1 und 9 als vorgeschaltete Regulatoren von AKT1 identifiziert, die für die durch AKT1 vermittelte K+-Aufnahme essentiell sind. Bei K+-Mangel werden räumlich und zeitlich spezifische Ca2+-Signaturen ausgelöst. Die steigenden cytosolischen Ca2+-Konzentrationen werden von CBL1 und 9 detektiert, welche daraufhin CIPK23 an die Plasmamembran rekrutieren. Durch ein komplexes Phosphorylierungsmuster, welches AKT1, CIPK23 und CBL1/9 involviert, wird die Aktivität des K+-Kanals gesteuert. Ziel dieses Projekts war die strukturelle und funktionale Analyse der an der AKT1-vermittelten K+-Aufnahme beteiligten Komponenten. Durch die Bestimmung der Struktur und der Interaktionen zwischen den Komponenten soll ein besseres Verständnis der Anpassungsmechanismen unter niedrigen K+-Bedingungen erreicht werden. Ein dahingehend erster Schritt war die Etablierung heterologer Expressions- und anschließender Reinigungsverfahren für das Multidomänen-Membranprotein AKT1 sowie das cytosolische CIPK23 und das membranassoziierte CBL1. Dazu wurde der etablierte prokaryotische Expressionswirt Escherichia coli, der eukaryotische Expressionswirt Saccharomyces cerevisiae sowie die zellfreie Expression auf der Basis von Weizenkeimlingen herangezogen. Der AKT1-Kanal konnte in S. cerevisiae ΔPP sowohl nach Plasmid-Transformation als auch nach homologer Rekombination des akt1-Gens in den pdr5-Lokus des S. cerevisiae ΔPP-Genoms exprimiert werden. Konfokale Fluoreszenz-Mikroskopie der Hefezellen, welche entweder N- oder C-terminal His-GFP-markierte AKT1-Fusionsproteine exprimierten, zeigten, dass die Position der Markierung Einfluss auf die Lokalisierung des Kanals hat. N-terminal markiertes AKT1 befand sich in der Plasmamembran, während der C-terminal markierte Kanal in inneren Kompartimenten der Hefezelle verblieb. Bei der Isolierung von AKT1-haltigen Membranen kam es zu einer Degradation des Proteins. Es konnten keine Membranen präpariert werden, welche AKT1 in voller Länge enthielten. Es zeigte sich, dass die Expression von CIPK23 in E. coli möglich ist, aber die Reinigung führte trotz verschiedener getesteter Bedingungen zu einer Degradation des Proteins. Auf Grund dessen wurden die für AKT1 als auch für CIPK23 codierenden Gene in spezielle Vektoren kloniert, welche für die zellfreie Expression geeignet sind. Beide Proteine konnten so in voller Länge hergestellt werden. Für AKT1 konnte ein erster Reinigungserfolg erzielt werden, während CIPK23 eine starke Aggregation aufwies. Die Expression des Ca2+-Sensors CBL1 in E. coli Rosetta pLysS und die anschließende Reinigung über eine N-terminale StrepII-Markierung konnte in dieser Arbeit etabliert werden. Im Gegensatz zu den bereits etablierten Reinigungen für CBL2 und CBL4 zeigte die Mehrwinkel-Lichtstreuungsanalyse (MALS), dass CBL1 in höheren oligomeren Zuständen vorlag, wenn nicht während der Reinigung das Detergens BriJ35 zugesetzt wurde. CBL1 konnte so in ausreichenden Mengen gereinigt werden, um im Anschluss seine Bindungsaffinitäten für Ca2+, Mn2+ und Mg2+ mittels isothermer Titrationskalorimetrie zu analysieren. Neben Ca2+ waren auch Mn2+ und Mg2+ von Interesse, da festgestellt wurde, dass die EF-Hand 4 des verwandten CBL4 Mn2+ binden kann und einige Calmodulin-Varianten neben Ca2+ auch IV Mg2+ binden können. Die ITC-Analyse zeigte 3 potenzielle Bindungsstellen für Ca2+ bzw. Mn2+ und 1 potenzielle Bindungsstelle für Mg2+ auf. Durch die Erzeugung von EF Hand Mutanten, welche die Ca2+-Bindung je einer EF Hand beeinträchtigten (E → Q an der konservierten -Z-Koordinate), konnten die ermittelten KD und ΔH Werte den verschiedenen EF-Händen zugeordnet werden. Anhand dessen wurde festgestellt, dass EF Hand 2 kein Ca2+ bindet, während für die anderen 3 EF Hände ein in vivo Bindungsmodell postuliert wurde. Die Mg2+ Bindung erwies sich als nicht relevant. Das in vivo-Bindungsverhalten für Mn2+ konnte nicht zweifelsfrei geklärt werden, ein möglicher in vivo Einfluss kann jedoch nicht ausgeschlossen werden. Insbesondere die Ergebnisse für CBL1 können als Grundlage für die Analyse der übrigen CBL-Proteine dienen und werden in Zukunft bei der Entschlüsselung der Ca2+-Signaturen und deren Auswirkungen auf die Pflanze hilfreich sein. Plants play essential roles for all living matter on earth, be it in the compensation of CO2 or as food source for humans and animals. Hence the understanding of plants themselves and their nutrition is of high interest. If a nutrient runs low in the soil, plants as sessile organisms have to adapt to these changes. This study focused on a membrane protein of the model plant Arabidopsis thaliana that was found to be involved in the K+ uptake under low K+ conditions in the soil, namely the voltage gated K+ channel AKT1. Upon in planta and Xenopus oocyte experiments the protein kinase CIPK23 and the plasma membrane associated Ca2+ sensor proteins CBL1 and 9 were found as upstream regulators of AKT1 and essential for AKT1 mediated K+ uptake. Upon K+ deprivation spatio temporal specific Ca2+ signatures are triggered. The increasing cytosolic Ca2+ concentrations are sensed by CBL1 and 9, which thereupon recruit CIPK23 to the plasma membrane. Upon a complex phosphorylation pattern the activity of the K+ channel gets promoted. This project aimed towards the structural and functional analysis of the components involved in AKT1 mediated K+ uptake. By getting to know the structure and interaction between the components a better understanding in the adaption mechanisms under low K+ conditions should be obtained. A first step towards this aim was the establishment of heterologous expression and subsequent purification procedures for the multi domain membrane protein AKT1 as well as the cytosolic CIPK23 and the membrane associated CBL1. Therefore, the well established procaryotic expression host Escherichia coli, the eukaryotic expression host Saccharomyces cerevisiae as well as wheat germ based cell free expression was attempted. The AKT1 channel showed expression in S. cerevisiae ΔPP for both expression after plasmid transformation as well as after homologous recombination of the akt1 gene into the pdr5 locus of the S. cerevisiae ΔPP genome. Confocal fluorescence microscopic analysis of yeast cells expressing either N- or C-terminally His-GFP tagged AKT1 fusion proteins showed that the position of the tag determined the localization of the channel. N-terminally tagged AKT1 was found in the plasma membrane, while the C-terminally tagged channel remained in inner compartments of the yeast cell. The isolation of AKT1 membranes did yield in degradation and no membranes containing full length AKT1 could be obtained. Expression of CIPK23 in E. coli was shown to work, but purification resulted in degradation despite different conditions tested. Hence, the genes for both AKT1 and CIPK23 were cloned into vectors suitable for wheat germ based cell free expression. Both proteins could be produced in full length. For AKT1 initial purification success could be obtained, while the CIPK23 protein showed severe aggregation. The expression of the Ca2+ sensor CBL1 in E. coli Rosetta pLysS and subsequent purification via an N-terminal StrepII tag could be established in this study. In contrary to the already established purification protocols for CBL2 and CBL4, multi angle light scattering analysis showed that CBL1 was present in higher oligomeric states unless BriJ35 detergent was added during the purification procedure. CBL1 could be purified in sufficient amounts for subsequent analysis of its binding affinities for Ca2+, Mn2+ and Mg2+ by isothermal titration calorimetry. Besides Ca2+, Mn2+ and Mg2+ were found to be of interest since the EF hand 4 of the related CBL4 was found to bind Mn2+ and some calmodulin variants can bind Mg2+ besides Ca2+. This ITC analysis resulted in 3 potential binding sites for Ca2+ and Mn2+ respectively and 1 potential binding site for Mg2+. Upon the creation of mutants that impaired Ca2+ binding (E → Q at the conserved -Z coordinate), the determined KD and ΔH values could be assigned to the different EF hands. EF hand 2 was found to be impaired for Ca2+ binding, while for the other 3 EF hands an in vivo binding model was postulated. Mg2+ binding is found not to be relevant. The in vivo binding behavior II for Mn2+ could not be clarified beyond doubt, but a possible in vivo impact cannot be excluded. Especially the findings for the CBL1 can be used as basis for the analysis of the remaining CBL proteins and will be helpful to decipher the Ca2+ signatures and their impact on the plant in the future.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	05.10.2023
Dateien geändert am:	05.10.2023
Promotionsantrag am:	01.06.2023
Datum der Promotion:	14.08.2023