Dokument: In-vitro-Untersuchung der Differenzierungsinhibition von porkinen adipogenen multipotenten mesenchymalen Stromazellen

Titel:	In-vitro-Untersuchung der Differenzierungsinhibition von porkinen adipogenen multipotenten mesenchymalen Stromazellen
Weiterer Titel:	In-vitro study of differentiation inhibition of porcine adipogenic multipotent mesenchymal stromal cells
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63700
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230918-150619-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Krakau, Thomas [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,34 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.09.2023 / geändert 18.09.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Suschek, Christoph V. [Gutachter] PD Dr. Mahotka, Csaba [Gutachter]
Stichwörter:	Differenzierungsinhibition, osteogene Differenzierung, BMP-2
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Im Rahmen der Behandlung von kritischen Knochendefekten liegt ein vielversprechender therapeutischer Ansatz in der Implantation autologer multipotenter mesenchymaler Stromazellen. Im Schweinemodell konnte gezeigt werden, dass die osteogene Differenzierung porkiner adipogener multipotenter Stromazellen (pASC) inhibiert ist und diese Inhibition unter Zusatz von bone morphogenetic protein 2 (BMP-2) aufgehoben werden kann. In dieser Arbeit sollen die molekularbiologischen Ursachen dieser Inhibition der osteogenen Differenzierung von pASC weiter aufgeklärt werden. Insbesondere stellt sich die Frage, inwiefern eine Zugabe von BMP-2 die für die osteogene Differenzierung wichtigen Signalwege (TGF-β-, MAPK-, Wnt- und den FGF-Signalweg) modulieren kann. Für die Studie wurden multipotente mesenchymale Stromazellen aus dem Unterhautfettgewebe von verschiedenen porkinen Donoren isoliert (pASC) und anschließend mittels Durchflusszytometrie charakterisiert. Als osteogenes Differenzierungsmedium (OM) wurde DMEM (4,5 g Glucose/l) unter Zugabe von 10 % FBS, 1 % Penicillin/ Streptomycin, 100 nmol Dexamethason, 100 µmol Ascorbin-2-Phosphat und 10 mM β-Glycerophosphat verwendet. Über einen Zeitraum von 28 Tagen wurde die osteogene Differenzierung unter fakultativer Zugabe von 450 ng / ml BMP-2 durch die Evaluation der Kalzifizierung der extrazellulären Matrix mittels Alizarinrot-S-Färbung visualisiert und anschließend durch Rücklösung in Cetylpyridiniumchloridlösung quantifiziert. Weiterhin erfolgte mittels Western-Blot-Analyse die Untersuchung der Schlüsselproteine der für die osteogene Differenzierung wichtigen Signalkaskaden. Zudem wurde die Expression der charakteristischen Rezeptoren für den BMP-Signalweg (ALK2 und ALK6) und den TGF-β-Signalweg (ALK4, ALK5, ALK7) mittels Durchflusszytometrie evaluiert. Zunächst konnte gezeigt werden, dass die osteogene Differenzierung von pASC von BMP-2 essentiell abhängig ist. Weiter wurde demonstriert, dass die zusätzliche Applikation von BMP-2 zu einer Induktion des p38-MAPK-Signalweges innerhalb der ersten sieben Tagen führte. Dagegen war über den gesamten Untersuchungszeitraum kein signifikanter Unterschied in Bezug auf den Wnt-Signalweg zu evaluieren. Ferner zeigte sich, dass ab Tag 19 der TGF-β-Signalweg bei tendenzieller Induktion des BMP-spezifischen Rezeptors ALK6 effektiv inhibiert wurde. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aufhebung der Inhibition der osteogenen Differenzierung der pASC mit einer frühen Induktion des p38-MAPK-Signalweges assoziiert ist, der Wnt-Signalweg ebenso wie der FGF-Signalweg jedoch keinen Einfluss auf die Inhibition zu haben scheint. The implantation of autolog multipotent mesenchymal stromal cells is a promising approach in therapy of bone defects of critical size. The osteogenic differentiation of porcine adipogen multipotent stromal cells (pASC) in standardized osteogenic differentiation medium (OM) is inhibited. This inhibiton can be overcome by addition of bone morphogenetic protein 2 (BMP-2). The molecular reasons of this inhibition will be investigated in this work. The modulation of the four for the osteogenetic differentiation important pathways (TGF-β-, MAPK-, Wnt- and FGF-pathway) through BMP-2 will be evaluated in particular. After isolation of pASC from porcine subcutaneous fat tissue the surface markers were characterized by flow cytometry. DMEM (4,5 g glucose/l) with 10 % FBS, 1 % penicillin/ streptomycin, 100 nmol dexamethasone, 100 µmol ascorbic-2-phosphate and 10 mM β-glycerophosphate was used as OM. Over a period of 28 days the osteogenic differentiation with optional addition of 450 ng / ml BMP-2 was evaluated by the calcification of the extracellular matrix through alizarinred-s-staining and quantified by the solution in cetylpyrimidiumchloride. Furthermore, the expression of the key proteins of the pathways was measured using western blot analysis. The expression of the characteristic receptors for the BMP pathway (ALK2 and ALK6) and TGF-β pathway (ALK4, ALK5, ALK7) was analyzed by flow cytometry. In this study it could be shown that the osteogenic differentiation of pASC is essentially dependent on BMP-2. The application of BMP-2 led to the induction of p38-MAPK-pathway within seven days. Over the entire study period of 28 days there was no significant difference in relation to Wnt-pathway. From day 19 the TGF-β-pathway was inhibited, although the BMP-specific receptor ALK6 was upregulated at this time. In summary, these results suggest, that the reversal of the inhibition of osteogenic differentiation is associated with an early induction of the p38-MAPK-pathway. The Wnt- and the FGF-pathways don’t appear to have an influence on the reversal of this inhibition.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	18.09.2023
Dateien geändert am:	18.09.2023
Promotionsantrag am:	11.03.2023
Datum der Promotion:	14.09.2023