Dokument: Multiparameter Fluorescence Spectroscopy and Microscopy of Biomolecular Systems
| Titel: | Multiparameter Fluorescence Spectroscopy and Microscopy of Biomolecular Systems | |||||||
| Weiterer Titel: | Multiparameter-Fluoreszenzspektroskopie und Mikroskopie von Biomolekularen Systemen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63569 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230920-111340-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Koch, Julian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Seidel, Claus A. M. [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Kedrov, Alexej [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | FRET, Fluorescence Microscopy, T4L, hGBP, mGBP, KDM6A, UTX | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | This work aims to characterize four different biomolecular systems of increasing complexity with fluorescence spectroscopy and imaging as well as biochemical methods in vitro and in cells, achieving temporal-spatial information on a molecular and cellular level. Proteins, the most complex biomolecules, maintain their functionality via specific three-dimensional structure and dynamic movements. Therefore, understanding the structure and dynamics of proteins will usually yield functional knowledge as well, which is the key for many major contributions in life sciences. Fluorescence spectroscopy is a highly viable tool to accurately resolve structures and dynamics on a molecular level. Coupled with complementary
methods like fluorescence imaging and biochemical basics, we were able to achieve a comprehensive readout over a magnitude of spatial and temporal scales. The first project aimed to characterize an unassigned quenching state found in single labeled T4-lysozyme (T4L). By using truncated T4L variants to suppress internal dynamics, we contextualized the unknown state within the known dynamics of T4L. In the second project, we followed domain movements upon dimerization of human guanylate binding protein 1 (hGBP1) on a millisecond timescale with a stopped-flow coupled ensemble time correlated photon counting setup (SF-eTCSPC). Changes in Förster resonance energy transfer (FRET) efficiency enabled us to monitor the transition of the molecule from a monomer into a (semi-)elongated dimer. The third project aimed to characterize protein-protein interaction and oligomerization behavior of murine guanylate-binding protein 7 (mGBP7) with two other mGBPs, mGBP2 and mGBP3. We used multi-parameter image fluorescence spectroscopy (MFIS), fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and image analysis tools to show and explain the dynamic and specific assembly of mGBP7 with mGBP3 in a colocalized/mixed phase and with mGBP2 in a spatially separated phase. Lastly, the lysine demethylase 6A (KDM6A) was complementary characterized regarding demethylase activity, interaction ability, cellular localization, protein stability of KDM6A variants and their relation to malignant cellular phenotypes. Here, we used a primarily biochemical toolset in synergy with fluorescence spectroscopy and fluorescence imaging. We showed that truncated variants of KDM6A cause significant levels of cellular damage and apoptosis, while substitution variants only show mild effects. Ultimately, this work gives a comprehensive insight into the strengths and limitations of our methods and delivers valuable readout to further investigate and understand the four characterized protein systems.In dieser Arbeit wurden vier unterschiedliche biomolekulare Systeme steigender Komplexität mit Fluoreszenzspektroskopie, Fluoreszenzmikroskopie und biochemischen Methoden charakterisiert. Dabei wurden zeitlich und räumlich aufgelöste Ergebnisse auf molekularen und zellulären Ebenen erzielt. Proteine, komplexe Biomoleküle, üben ihre Funktion über spezifische dreidimensionale Strukturen und Dynamiken aus. Kennt man die Struktur und die Bewegungsabläufe eines Proteins, kann man funktionelle Zusammenhänge verstehen – das ist der Schlüssel für viele beutende Entdeckungen innerhalb der Lebenswissenschaften. Fluoreszenzspektroskopie ist dabei ein wichtiges Werkzeug, um Strukturen und Dynamiken auf molekularem Level mit hoher Präzision und Richtigkeit aufzulösen. Zusammen mit ergänzenden Methoden aus der Fluoreszenzmikroskopie und biochemischen Methoden können somit Ergebnisse innerhalb einer großen Reichweite in zeitlicher und räumlicher Auflösung erzielt werden. Im ersten Projekt wurde ein fotophysikalischer Prozess unbekannter Herkunft in Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie-Messungen von T4-Lysozym (T4L) untersucht. Mithilfe von verkürzten T4L-Proteinen konnten wir den unbekannten Prozess innerhalb der bekannten Dynamiken von T4L einordnen. Im zweiten Projekt konnten Proteindomänenbewegungen im Dimerisierungsprozesses des humanen Guanylat-Bindeprotein 1 (hGBP1) in einem Millisekunden-Zeitfenster dargestellt werden. Dazu wurde eine flussunterbrechende Analyse gekoppelt an eine zeitkorrelierte Einzelphotonenzählung (Ensemble) genutzt (SF-eTCSPC). Änderungen in der Effizienz des Förster-Resonanz Energietransfers ermöglichte uns, die Konformationsänderung von einem Monomer zu einem halbausgestreckten Dimer zu beobachten. Im dritten Projekt wurden die Protein- Protein-Interaktionen und Oligomerisierung des murinen Guanylat-Bindeproteins 7 (mGBP7) mit zwei weiteren mGBPs, mGBP2 und mGBP3 charakterisiert. Durch Einsatz von bildgebender Mehrparameter-Fluoreszenzspektroskopie (MFIS), Fluoreszenzregeneration nach Fotobleichung (FRAP) und Bildanalysen konnte gezeigt werden, dass mGBP7 und mGBP3 in einer kolokalisierten, gemischten Phase vorliegen, während mGBP7 und mGBP2 räumlich voneinander getrennt sind. Abschließend wurde die Lysin-Demethylase 6A (KDM6A) umfassend im Hinblick auf Demethylaseaktivität, Interaktion, Lokalisation, Stabilität und den resultierenden zellulären Phänotypen untersucht. Dafür wurde ein hauptsächlich biochemisches Methodenset in Kombination mit Fluoreszenzmikroskopie und Fluoreszenzspektroskopie verwendet. Wir konnten zeigen, dass verkürzte Varianten von KDM6A zellulären Schaden und Apoptose induzierten, während punktmutierte Varianten lediglich einen milden Effekt auf die Zellen hatten. Insgesamt gibt diese Arbeit einen umfassenden Einblick in die Stärken und Herausforderungen unserer Methoden und liefert viele Einblicke sowie neue Grundlagen für die weitere Arbeit mit den vier Systemen. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Physikalische Chemie und Elektrochemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.09.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 20.09.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.10.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 24.04.2023 |
