Dokument: Directed Evolution of HlyA Type I Secretion System from Escherichia Coli
Titel: | Directed Evolution of HlyA Type I Secretion System from Escherichia Coli | |||||||
Weiterer Titel: | Directed Evolution des HlyA Typ I Sekretionssystems von Escherichia Coli | |||||||
URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63375 | |||||||
URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230821-083615-0 | |||||||
Kollektion: | Dissertationen | |||||||
Sprache: | Englisch | |||||||
Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
Medientyp: | Text | |||||||
Autor: | Pourhassan Najafabadi, Zohreh [Autor] | |||||||
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Beitragende: | Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] | |||||||
Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
Beschreibungen: | Type 1 secretion systems (T1SS) are transport machineries wide spread among Gram-negative bacteria. T1SS translocon comprises an ABC transporter, a membrane fusion protein (MFP), and an outer membrane protein (OMP). The ABC transporter and the MFP form a complex in the inner membrane, while the OMP is recruited upon substrate recognition in the cytosol. The substrate is then translocated from the cytosol to the extracellular space through the translocon in one step, without a periplasmic intermediate.
T1SS are attractive candidates to be used as secretion hosts in different biotechnological applications due to their relatively simple architecture and easy plasmid-based expression compared to other secretion systems. However, their potential application as a secretion platform, particularly at large scales, is still limited by low secretion titers for some heterologous proteins. In this thesis, the focus was on the HlyA T1SS from Escherichia coli to improve the secretion efficiency of the system. For this purpose, three KnowVolution campaigns were separately applied to the Hly enhancer fragment, the ABC transporter HlyB, and the MFP HlyD. This strategy is an integrative protein engineering approach, which uses a combination of directed evolution and computational analysis to achieve maximum improvement with minimal experimental efforts. The study also used a high-throughput screening system for directed evolution of a T1SS (the HlyA system) for the first time. In addition, it was shown that involving a native terminator region further enhances the secretion level. Researchers have already shown that the amount of TolC is constant under the overexpression condition of the inner membrane components (HlyB and HlyD), leading to the question of whether the amount of TolC is the limiting factor for the HlyA secretion. To address this question, the secretion efficiency was compared under condition of either the endogenous level or the overexpression of TolC protein. It was shown that TolC overexpression impairs the secretion efficiency. Finally, this thesis dealt with the interaction between the nucleotide binding domain (NBD) of HlyB and the substrate HlyA. The interaction regions on the NBD for the secretion signal of HlyA were mapped, and two binding pockets were identified. The presence of these two binding pockets was supported with in silico, in vivo, and in vitro analysis. Noteworthy, it was proposed that the presence of a consensus length between the GG repeat and the amphiphilic helix affects on the secretion efficiency of heterologous proteins secreted by the HlyA T1SS.Typ-1-Sekretionssysteme (T1SS) sind unter gramnegativen Bakterien weit verbreitete Transportmaschinen. Das T1SS-Translokon umfasst einen ABC-Transporter, ein Membranfusionsprotein (MFP) und ein äußeres Membranprotein (OMP). Der ABC-Transporter und das MFP bilden einen Komplex in der inneren Membran, während das OMP bei der Substraterkennung im Cytosol rekrutiert wird. Das Substrat wird dann durch das Translokon in einem Schritt aus dem Zytosol in den extrazellulären Raum transportiert, ohne ein periplasmatisches Intermediat zu bilden. Aufgrund ihrer relativ einfachen Architektur und Plasmid-basierten Expression sind T1SS in verschiedenen biotechnologischen Anwendungen als Sekretionswirte attraktive Kandidaten im Vergleich zu anderen Sekretionssystemen. Ihre potenzielle Anwendung als Sekretionsplattform, insbesondere im großen Maßstab, ist jedoch immer noch durch niedrige Sekretionstiter auf einige heterologe Proteine begrenzt. In dieser Arbeit lag der Fokus auf dem HlyA T1SS aus Escherichia coli um die Sekretionseffizienz des Systems zu verbessern. Zu diesem Zweck, drei KnowVolution-Kampagnen wurden separat auf das Hly-Enhancer-Fragment, den ABC-Transporter HlyB und das MFP-HlyD angewendet. Diese Strategie ist ein integrativer Protein-Engineering-Ansatz, der eine Kombination aus gerichteter Evolution und Computeranalyse verwendet, um mit minimalem experimentellen Aufwand eine maximale Verbesserung zu erreichen. Die Studie verwendete zum ersten Mal auch ein Hochdurchsatz-Screening-System für die gerichtete Evolution eines T1SS (das HlyA-System). Zusätzlich wurde gezeigt, dass die Einbeziehung einer nativen Terminatorregion das Sekretionsniveau weiter erhöht. Forscher haben bereits gezeigt, dass die TolC-Menge unter der Überexpressionsbedingung der inneren Membrankomponenten (HlyB und HlyD) konstant ist, was zu der Frage führt, ob die Menge an TolC der limitierende Faktor für die HlyA-Sekretion ist. Um diese Frage zu beantworten, wurde die Sekretionseffizienz entweder unter der Bedingung des endogenen Spiegels oder der Überexpression des TolC-Proteins verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass die Überexpression von TolC die Sekretionseffizienz beeinträchtigt. Abschließend befasste sich diese Arbeit mit der Wechselwirkung zwischen der Nukleotidbindedomäne (NBD) von HlyB und dem Substrat HlyA. Die Interaktionsregionen auf der NBD für das Sekretionssignal von HlyA wurden erfasst und zwei Bindungstaschen wurden identifiziert. Das Vorhandensein dieser beiden Bindungstaschen wurde durch In-silico-, In-vivo- und In-vitro-Analysen gestützt. Bemerkenswerterweise wurde vorgeschlagen, dass das Vorhandensein einer Konsensuslänge zwischen der GG-Wiederholung und der amphiphilen Helix die Sekretionseffizienz von heterologen Proteinen, die vom HlyA T1SS sekretiert werden, beeinflusst. | |||||||
Lizenz: | ![]() Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie | |||||||
Dokument erstellt am: | 21.08.2023 | |||||||
Dateien geändert am: | 21.08.2023 | |||||||
Promotionsantrag am: | 15.03.2023 | |||||||
Datum der Promotion: | 11.05.2023 |