Dokument: Analyse der Sequenzvariabilität des Hepatitis B Virus unter dem Einfluss der CD8 T-Zellantwort auf Populationsebene

Titel:	Analyse der Sequenzvariabilität des Hepatitis B Virus unter dem Einfluss der CD8 T-Zellantwort auf Populationsebene
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63295
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230804-105215-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schwarz, Tatjana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 15,49 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.08.2023 / geändert 09.08.2023
Beitragende:	Timm, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, Johannes [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Trotz der Verfügbarkeit einer prophylaktischen Impfung haben schätzungsweise 296 Millionen Menschen weltweit eine chronische Hepatitis B Virus (HBV)-Infektion. Davon sterben jährlich um die 820.000 Menschen an den Folgen einer HBV-induzierten Zirrhose oder einem hepatozellulären Karzinom. Bei einer Infektion im Erwachsenenalter können bis zu 95 % der infizierten Patienten das Virus eliminieren. Allerdings kann nach der Ausheilung einer akuten Hepatitis das virale Genom als cccDNA in infizierten Hepatozyten weiterhin persistieren. Derzeit sind in Deutschland zwei pharmakologische Therapieansätze zur Behandlung einer chronischen HBV-Infektion zugelassen. Diese führen jedoch nur selten zu einer Ausheilung der Infektion, sodass häufig eine dauerhafte Therapie notwendig ist. Daher ist die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen von großer medizinischer Bedeutung. Eine mögliche neue Therapiestrategie basiert auf der Entwicklung einer therapeutischen Impfung unter Verwendung von zytotoxischen CD8 T-Zellen, da diese maßgeblich an der Ausheilung beteiligt sind. Allerdings hat HBV verschiedene Immunevasionsmechanismen entwickelt, um der CD8 T-Zellantwort zu entkommen. Beispielsweise werden unter dem immunologischen Druck Substitutionen in Zielantigenen selektiert. Um das Ausmaß dieser Form der Anpassung an den Immundruck über das komplette HBV-Genom zu charakterisieren, wurde in dieser Dissertation die Sequenzvariabilität des HBV unter dem Einfluss der CD8 T Zellantwort auf Populationsebene analysiert. Dazu wurde eine Kohorte von 544 chronisch HBV-infizierten Patienten rekrutiert und zunächst das komplette HBV-Genom amplifiziert und sequenziert. Die phylogenetische Analyse der Sequenzen ergab, dass Patienten in dieser Kohorte überwiegend mit dem in Europa sehr verbreiteten Genotyp D (n=379) infiziert waren. Die anschließende HLA-Klasse I-Genotypisierung von allen Patienten ermöglichte die Durchführung von Assoziationsstudien zwischen der HBV-Sequenz und dem HLA Klasse-I-Allel des Wirts. Mit Hilfe des Tools SeqFeatR wurde analysiert, ob es Assoziationen zwischen Aminosäurepolymorphismen bei Genotyp D infizierten Patienten und bestimmten HLA Klasse I-Allelen gab, welche als HLA-Footprints bezeichnet werden. Insgesamt wurden 111 HLA Footprints identifiziert, davon 78 im PräCore/Core-Protein, 25 in der Polymerase, 2 im Hüllprotein und 5 im HBx-Protein. Somit wurde einerseits deutlich, dass in allen HBV Proteinen eine Anpassung an den CD8 T-Zell-Selektionsdruck erfolgt und andererseits, dass der Selektionsdruck auf das Core-Protein besonders ausgeprägt ist. Die 111 HLA-Footprints verteilten sich auf 70 Positionen, wobei in 44 Positionen Assoziationen von Substitutionen mit nur einem HLA-Klasse-I-Allel und in 26 Positionen Assoziationen mit multiplen HLA-Klasse-I-Allelen gefunden wurden. Aufgrund der überlappenden offenen Leserahmen wurde ein HLA Klasse I assoziierter Selektionsdruck im Core-Protein und der Polymerase detektiert, der zu Substitutionen in beiden Proteinen führte. Für die Detektion von Assoziationen mit multiplen Allelen waren zwei Gründe verantwortlich; erstens übten mehrere HLA-Klasse-I-Allele einen Selektionsdruck auf eine Position aus, und zweitens wurde HLA-Klasse-I Linkage Disequilibrium beobachtet. Durch die Identifizierung von HLA Footprints konnten gleichzeitig neue HBV-Epitope erfolgreich gefunden werden. Mit Hilfe der Sequenzanalyse und Algorithmen zur Vorhersage von Peptid-Liganden für die entsprechenden HLA-Allele wurden 30 neue potenzielle CD8 T-Zell-Epitope identifiziert, von denen sieben Epitope (fünf im Core-Protein und zwei in der Polymerase) durch die Stimulation von PBMCs mit Peptiden immunologisch bestätigt. Ein weiterer wichtiger Aspekt, der in dieser Dissertation untersucht wurde, ist der Einfluss des CD8 T-Zell-Selektionsdrucks auf klinische Parameter wie Viruslast und die Bedeutung des HBeAg-Status. Dabei wurde deutlich, dass es eine negative Korrelation zwischen der Anzahl von Substitutionen in den 70 Positionen unter Selektionsdruck und der HBV-Viruslast gibt. Je mehr HLA-Klasse-I-assoziierte Substitutionen im HBV-Genom eines Patienten waren, desto niedriger war die Viruslast. Darüber hinaus fanden sich Hinweise, dass auch einzelne Substitutionen die virale Fitness entweder beeinträchtigen oder fördern können. Auch der HBeAg-Status hatte einen Einfluss auf die HBV-Viruslast; HBeAg-positive Patienten hatten eine signifikant höhere Viruslast als HBeAg-negative Patienten. Dies ging damit einher, dass die relative Häufigkeit von Substitutionen in Anwesenheit des relevanten HLA-Klasse-I-Allels in HBeAg-positiven Patienten signifikant niedriger war als in HBeAg-negativen Patienten. Zusätzlich dazu hatten HBeAg-negative Patienten, die an Position W28 des PräCore-Proteins ein Stoppcodon (W28*) hatten und somit kein HBeAg mehr exprimieren konnten, signifikant häufiger HLA-Klasse-I-assoziiertere Substitutionen als HBeAg-negative Patienten, die an Position W28 die Prototypsequenz hatten. Der Selektionsdruck scheint also über die Stadien HBeAg positiv – HBeAg negativ ohne PräCore-Mutation – HBeAg negativ mit PräCore Mutation kontinuierlich zuzunehmen. Dabei könnte die W28*-Substitution nach HBeAg-Serokonversion eine Art „übergeordnete“ Immunevasionsvariante sein, indem die Verfügbarkeit des Proteins und damit der Epitope im Core-Protein reduziert wird. Neben einzelnen T-Zell-assoziierten Substitutionen wurde anhand der Sequenz-Datenbank in frame Deletionen im überlappenden Leserahmen der Polymerase und des Hüllproteins beobachtet. Sowohl klonale Experimente als auch NGS-Daten bestätigten diese Deletionen und zeigten, dass innerhalb der Quasispezies Viren mit und ohne Deletionen vorhanden waren. Des Weiteren zeigte die durchgeführte Assoziationsstudie, dass Deletionen in Anwesenheit von HLA-A*24 bzw. HLA-B*35 angereichert waren. Der immunologische Nachweis von HLA-B*35-restringierten Epitopen innerhalb der Region mit Deletionen stützt die Hypothese, dass CD8 T-Zell Selektionsdruck zur Entstehung von Deletionen beigetragen haben könnte. Folglich könnten Deletionen einen weiteren Evasionsmechanismus von HBV darstellen. Abschließend lässt sich sagen, dass die hier präsentierten Ergebnisse darauf hinweisen, dass der CD8 T-Zell-assoziierte Selektionsdruck großen Einfluss auf die Evolution von HBV hat, einerseits durch die Selektion von einzelnen Substitutionen und andererseits durch in-frame Deletionen. Vor allem der beobachtete prädominante Selektionsdruck auf das Core-Protein könnte ein Hindernis für die therapeutische Impfstoffentwicklung darstellen, da Core-spezifische CD8 T-Zellen aufgrund ihrer Assoziation mit der Ausheilung einer HBV-Infektion als gute Kandidaten für eine Immuntherapie angesehen werden. Weitere Studien sind notwendig, um z. B. die Bedeutung der Selektion von HBeAg-Varianten für die CD8 T Zellantwort besser zu charakterisieren. Although prophylactic vaccination against HBV is widely available, worldwide 296 million people are chronically infected with HBV. Annually, an estimated 820,000 people die from HBV-induced cirrhosis or hepatocellular carcinoma. HBV infection acquired in adulthood leads to virus elimination in up to 95 % of cases. However, after recovery from acute hepatitis, the viral genome can persist as cccDNA in infected hepatocytes. In Germany, two pharmacological therapy approaches have been approved for treatment of chronic HBV infection. Nevertheless, a cure is rarely achieved, synonymous with long-term therapy for the patient. Therefore, the search for new therapeutic approaches is of great importance. A potential new therapeutic strategy is based on the development of a therapeutic vaccine consisting of cytotoxic CD8 T cells, as they are significantly involved in recovery. To escape the CD8 T cell response, HBV has developed several immune evasion mechanisms. For example, substitutions in target antigens are selected under immunological pressure. To characterize the extent of adaptation to immune pressure across the complete HBV genome, the sequence variability of HBV under the impact of the CD8 T cell response was analyzed at population level. A cohort of 544 chronically HBV-infected patients was recruited, and the complete HBV genome was amplified and sequenced. Phylogenetic analysis indicated that patients in this cohort were predominantly infected with genotype D (n=379), the most prevalent genotype in Europe. Following HLA class I genotyping of all patients, association studies between the HBV sequence and the host HLA class I allele were performed. The SeqFeatR tool was used to analyze potential associations between amino acid polymorphisms in genotype D infected patients and specific HLA class I alleles, referred to as HLA footprints. In total, 111 HLA footprints were identified; 78 in the precore/core protein, 25 in the polymerase, 2 in the envelope protein, and 5 in the HBx protein. These results showed that an adaptation to CD8 T cell selection pressure occurs in all HBV proteins and that selection pressure on the core protein is particularly pronounced. The 111 HLA footprints were found in 70 positions, with substitutions in 44 positions associated with only one HLA class I allele and in 26 positions with an association to multiple HLA class I alleles. Notably, due to the overlapping open reading frames, HLA class I associated selection pressure was detected in the core protein and polymerase, resulting in substitutions in both proteins. The association with multiple alleles was caused by two factors, firstly multiple HLA class I alleles exerted selection pressure on one position and secondly a HLA class I linkage disequilibrium. In parallel, new HBV epitopes could be detected through the identification of HLA footprints. Using sequence analyses and algorithms to predict peptide ligands to the corresponding HLA allele, 30 new potential CD8 T cell epitopes were identified, of which seven epitopes, five in core and two in polymerase, were immunologically confirmed by stimulating PBMCs with peptides. Furthermore, the influence of CD8 T cell selection pressure on clinical parameters such as viral load and the relevance of HBeAg status was studied. The HBV viral load negatively correlated with the number of substitutions in the 70 positions under selection pressure. The greater the number of HLA class I-associated substitutions in a patient's HBV genome, the lower the viral load. In addition, some substitutions could either impair or promote viral fitness. The HBeAg status also had an impact on HBV viral load, HBeAg-positive patients had a significantly higher viral load than HBeAg-negative patients. This was accompanied by the fact that the relative frequency of substitutions in the presence of the relevant HLA class I allele was significantly lower in HBeAg-positive patients compared to HBeAg-negative patients. In addition, HBeAg-negative patients whose HBV sequence had a stop codon (W28*) at position W28 of the precore protein and therefore failed to express HBeAg had significantly more frequent HLA class I associated substitutions compared to HBeAg-negative patients who harbored the prototype sequence at position W28. Hence, the selection pressure seems to continuously increase from the stages HBeAg positive - HBeAg negative without precore mutation - HBeAg negative with precore mutation. In this context, the W28* substitution after HBeAg seroconversion could be a ‘higher-order’ immune evasion variant by reducing the availability of the protein and thus the epitopes of the core protein. Apart from single T cell associated substitutions, in-frame deletions in the overlapping open reading frame of the polymerase and envelope protein were detected using the sequence database. Both, clonal experiments and NGS data confirmed these deletions and showed that viruses with deletions were present within the quasispecies. Furthermore, the association studies showed an enrichment of deletions in the presence of HLA-A*24 and HLA-B*35. The immunological identification of HLA-B*35-restricted epitopes within the deletion regions supports the hypothesis of CD8 T cell selection pressure contributing to the development of deletions. Consequently, deletions might represent another evasion mechanism of HBV. Taken together, CD8 T cell associated selection pressure has a major impact on the evolution of HBV, on the one hand through the selection of single substitutions and on the other hand by in- frame deletions. Especially, the observed predominant selection pressure on the core protein might be an obstacle for therapeutic vaccine development, as core-specific CD8 T cells are considered as good candidates for immunotherapy due to their association with the clearance of HBV infection. Further studies are necessary, for example, to characterize the impact of HBeAg variant selection on the CD8 T cell response.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Virologie
Dokument erstellt am:	04.08.2023
Dateien geändert am:	09.08.2023
Promotionsantrag am:	21.12.2021
Datum der Promotion:	10.06.2022