Dokument: Bedeutung der kidney-type Glutaminase für durch Ammoniak vermittelten oxidativen Stress und Seneszenz in Astrozyten in vitro
| Titel: | Bedeutung der kidney-type Glutaminase für durch Ammoniak vermittelten oxidativen Stress und Seneszenz in Astrozyten in vitro | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63252 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230809-131106-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Czeszewski, Linda Tanja [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Häussinger, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Butz, Markus [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Ammoniak ist ein Haupttoxin bei der Hepatischen Enzephalopathie (HE) und dessen Entgiftung über die Bildung von Glutamin in Astrozyten spielt eine wichtige Rolle für die pathophysiologischen Veränderungen im Gehirn im Rahmen dieser Erkrankung. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind derzeitig nicht vollständig verstanden, aber es wurde vermutet, dass dabei der Hydrolyse von Glutamin durch eine in Astrozyten exprimierte Glutaminase eine Bedeutung zukommt.
In der vorliegenden Arbeit wurde anhand von Immunfluoreszenzanalysen nachgewie-sen, dass Rattenastrozyten in vitro und im Rattenhirn in situ die kidney-type Gluta-minase (KGA) und die Glutaminsynthetase (GS) koexprimieren. Auch mittels Wes-tern-Blot-Analyse konnte das KGA-Protein in Astrozyten in vitro nachgewiesen und gezeigt werden, dass die Inkubation mit NH4Cl (5 mmol/l) deren Proteinkonzentration zeitabhängig steigert. Dieser Effekt war reversibel und 24 Stunden nach Wegnahme von NH4Cl waren die KGA-Proteinspiegel auf das Niveau der Kontrollen abgefallen. Weitere Immunfluoreszenzanalysen zeigten, dass die KGA u.a. in den Mitochondrien lokalisiert ist und dass NH4Cl die KGA-Proteinkonzentration in den Mitochondrien steigert. Die NH4Cl-induzierte Hochregulation des KGA-Proteins wurde durch die Glu-taminsynthetasehemmstoffe Methionin-Sulfoximin (MSO) und Phosphinothricin (PPT) sowie durch siRNA-vermittelten Knockdown der Glutamin-Fruktose-Amido-Transferasen 1 und 2 (GFAT1/2) gehemmt. Eine Hemmung der GS durch MSO und PPT allein reduzierte bereits die KGA-Proteinspiegel. Im Gegensatz zum Protein wur-de die mRNA-Konzentration der KGA durch NH4Cl (5 mmol/l) in einem Beobach-tungszeitraum von 72 Stunden nicht verändert. Der Knockdown der KGA hemmte außerdem die durch NH4Cl-induzierte Hochregulation des endoplasmatisch-retikulären (ER) Stress-Marker Proteins GRP78 und der Hämoxygenase 1, die eine wichtige Rol-le für durch Ammoniak induzierten oxidativen Stress spielt. Auch die Proliferations-hemmung mit NH4Cl inkubierter Astrozyten wurde durch einen siRNA-vermittelten Knockdown der KGA verhindert. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deuten auf eine wichtige Rolle der KGA-vermittelten Hydrolyse von Glutamin für durch NH4Cl induzierten und Glutaminsynthe-se-abhängigen oxidativen und ER-Stress sowie Seneszenz in kultivierten Ratten-astrozyten hin.Ammonia is a major toxin in HE and its detoxification via the synthesis of glutamine in astrocytes plays an important role for pathophysiological changes in the brain in HE. The underlying mechanisms are currently not fully understood, but it has been sug-gested that glutamine, which becomes hydrolysed by a glutaminase which is expres-sed in astrocytes, may play an important role for astrocyte dysfunction in the patho-genesis of HE. In the present work it was demonstrated by means of immunofluorescence analyses that rat astrocytes in vitro and in the rat brain in situ coexpress kidney-type glutami-nase (KGA) and glutamine synthetase (GS). The KGA protein in astrocytes was also detected in vitro by means of Western blot analysis. Incubation with NH4Cl (5 mmol/l) increased KGA protein expression in a time dependent way. This effect was reversible and 24 hours after removal of NH4Cl KGA protein levels had fallen to the level of the controls. Further immunofluorescence analyses showed that the KGA is localized in the mitochondria and that NH4Cl increases the KGA protein level in the mitochondria. The NH4Cl-induced upregulation of the KGA protein was inhibited by the glutamine synthetase inhibitors methionine sulfoximine (MSO) and phosphinothricin (PPT) as well as by siRNA-mediated knockdown of glutamine fructose amido transferases 1 and 2 (GFAT1/2). Inhibition of GS by MSO and PPT alone already reduced the KGA protein level. In contrast to the protein, KGA mRNA levels were not changed by NH4Cl (5 mmol/l) within an observation period of 72 hours. The knockdown of KGA also in-hibited the NH4Cl-induced upregulation of the endoplasmic-reticular (ER) stress mark-er protein GRP78 and of heme oxygenase 1, which play an important role for ammo-nia-induced oxidative stress. The ammonia-induced proliferation inhibition of the ast-rocytes was also prevented by an siRNA-mediated knockdown of KGA. The results of the present work suggest an important role of KGA-mediated hydrolysis of glutamine for the ammonia-induced and glutamine synthesis-dependent induction of oxidative and ER stress and senescence in cultured rat astrocytes. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 09.08.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 09.08.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 24.02.2023 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.07.2023 |
