Dokument: The complex inositol metabolism of Corynebacterium glutamicum and its application for the production of rare inositols

Titel:	The complex inositol metabolism of Corynebacterium glutamicum and its application for the production of rare inositols
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63197
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20240820-084852-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ramp, Paul [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 119,73 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.07.2023 / geändert 18.07.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Inositols (cyclohexanehexols) comprise nine isomeric cyclic sugar alcohols, several of which occur in all domains of life with various functions. The most abundant isomer is myo-inositol (MI). Its rare isomers, scyllo- (SI) and D-chiro-inositol (DCI) are promising drug candidates for treating Alzheimer’s disease, diabetes type 2 and polycystic ovary syndrome. Therefore, cost efficient processes for the production of these compounds are desirable. Many bacteria can utilize inositols as carbon and energy source via a specific pathway involving inositol dehydrogenases (IDHs) as the first step of catabolism, followed by the actions of inosose isomerases. The microbial cell factory Corynebacterium glutamicum can grow on MI as sole carbon source and possesses many uncharacterized genes that are annotated to contribute to inositol degradation. It also has the innate ability to synthesize MI from glucose-6-phosphate. This thesis aimed to elucidate the function of the undescribed genes for inositol metabolism and exploit the potential of C. glutamicum to be engineered as a suitable host for the biotechnological production of SI and DCI. Throughout the studies reported in this thesis, C. glutamicum was found to grow on myo-,scyllo-, D-chiro- and L-chiro-inositol as single carbon and energy source. Overall, seven IDHs were identified of which the five: IolG, OxiB, IdhA3, OxiD and OxiE were characterized as NAD+-dependent and contribute differently to growth on the tested inositols. OxiC was without function while IolW proved to be an NADPH-dependent scyllo-IDH. Sequence alignments, crystal structure elucidation, structure modeling and molecular docking experiments revealed cofactor and substrate binding sites that can partially explain the reason behind inositol selectivity and different activities for the identified IDHs. To generate an efficient C. glutamicum chassis strain that cannot degrade inositols, 21 genes spread among two gene clusters had to be deleted. Overexpression of iolG and iolW in the generated chassis strain enabled efficient biotransformation of MI to SI, which could be optimized to 100% efficiency by changing media conditions. Combined expression of iolG with the newly discovered inosose isomerase cg0212 enabled production of DCI from MI. The heterologous expression of the plant-derived D-ononitol and D-pinitol dehydrogenase genes MtOEPa and MtOEPb enabled a novel biosynthesis route for DCI. Combining these processes with the overexpression of the myo-inositol-1-phosphate synthase ino1 in the C. glutamicum chassis strain enabled the production of 4.4.g/L SI and 1.2 g/L DCI starting directly from 20 g/L glucose or 20 g/L sucrose. Inositole (Cyclohexanhexole) umfassen neun zyklische Zuckeralkohol-Isomere, von denen mehrere in allen Bereichen des Lebens mit unterschiedlichen Funktionen vorkommen. Das am häufigsten vorkommende Isomer ist myo-Inositol (MI). Seine seltenen Isomere, scyllo- (SI) und D-chiro-Inositol (DCI), sind vielversprechende Arzneimittelkandidaten für die Behandlung der Alzheimer-Krankheit, von Diabetes Typ 2 und des polyzystischen Ovarsyndroms. Aufgrund dessen existiert die Nachfrage nach kosteneffizienten Verfahren für die Herstellung dieser Verbindungen. Viele Bakterien können Inositole als Kohlenstoff- und Energiequelle über einen spezifischen Abbauweg verstoffwechseln, an dem Inositol-Dehydrogenasen (IDHs) als erster Schritt des Katabolismus beteiligt sind, gefolgt von Inosose-Isomerasen. Die mikrobielle Zellfabrik Corynebacterium glutamicum kann auf MI als einzige Kohlenstoffquelle wachsen und besitzt viele noch nicht charakterisierte Gene, die zum Inositol-Abbau beitragen sollen. Es besitzt ebenfalls die Fähigkeit, MI aus Glucose-6-phosphat zu synthetisieren. Ziel dieser Arbeit war es, die Funktion der unbeschriebenen Gene für den Inositol-Stoffwechsel aufzuklären und das Potenzial von C. glutamicum als geeigneten Wirt für die biotechnologische Produktion von SI und DCI zu nutzen. In den Studien, über die in dieser Arbeit berichtet wird, wurde festgestellt, dass C. glutamicum auf myo-, scyllo-, D-chiro- und L-chiro-Inositol als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle wächst. Insgesamt wurden sieben IDHs identifiziert, von denen die fünf: IolG, OxiB, IdhA3, OxiD und OxiE als NAD+-abhängig charakterisiert wurden und unterschiedlich zum Wachstum auf den getesteten Inositolen beitragen. OxiC war ohne Funktion, während IolW sich als NADPH-abhängige scyllo-IDH erwies. Sequenzalignments, Kristallstrukturaufklärung, Strukturmodellierung und molekulare Docking-Experimente ergaben Kofaktor- und Substratbindungsstellen, die den Grund für die Inositolselektivität und die unterschiedlichen Aktivitäten der identifizierten IDHs teilweise erklären können. Um einen effizienten C. glutamicum-Chassis-Stamm zu erzeugen, der keine Inositole abbauen kann, mussten 21 Gene, verteilt auf zwei Gencluster, deletiert werden. Die Überexpression von iolG und iolW in dem erzeugten Chassis-Stamm ermöglichte eine effiziente Biotransformation von MI zu SI, die durch Anpassen der Medienbedingungen auf 100 % Effizienz optimiert werden konnte. Die kombinierte Expression von iolG mit der neu entdeckten Inosose-Isomerase cg0212 ermöglichte die Produktion von DCI aus MI. Die heterologe Expression der pflanzlichen D-ononitol- und D-pinitol-Dehydrogenasen MtOEPa und MtOEPb ermöglichte einen neuen Biosyntheseweg für DCI. Die Kombination dieser Prozesse mit der Überexpression der myo-Inositol-1-Phosphat-Synthase ino1 im C. glutamicum-Chassis-Stamm ermöglichte die Produktion von bis zu 4,4 g/L SI und 1,2 g/L DCI direkt aus 20 g/L Glucose oder 20 g/L Saccharose.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	20.08.2024
Dateien geändert am:	20.08.2024
Promotionsantrag am:	29.09.2022
Datum der Promotion:	23.03.2023