Dokument: Cloning and expression of lipoxygenase, hydroperoxide lyase and transaminase targeting the synthesis of polymer intermediates

Titel:	Cloning and expression of lipoxygenase, hydroperoxide lyase and transaminase targeting the synthesis of polymer intermediates
Weiterer Titel:	Klonierung und Expression der Lipoxygenase, Hydroperoxidlyase und Transaminase für die Synthese von Polymer-Intermediaten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=63185
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230724-111958-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Coenen, Anna Simone [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,20 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.07.2023 / geändert 17.07.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Schörken, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	Enzyme, Biotechnologie, Polymerintermediate, Enzymkaskade, Lipoxygenase, Hydroperoxid Lyase, Transaminase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In dieser Arbeit wurden neue Enzymkaskaden für die Synthese der Polymervorstufen 12 Oxododecensäure und 12-Aminododecensäure aus Linolsäure bzw. Distelöl entwickelt. Hierfür wurden eine Sojabohnen-Lipoxygenase (LOX), vier pflanzliche Hyroperoxidlyasen (HPLs) und sieben bakterielle ω-Transaminasen (ω-TAs) kloniert, in Escherichia coli exprimiert und charakterisiert. Die 13(S)-spezifische Lipoxygenase LOX-1 aus Glycine max (Sojabohne), die die Hydroperoxidierung von Linolsäure zu 13(S)-Hydroperoxyoctadecadiensäure (13(S)-HPODE) katalysiert, wurde erfolgreich kloniert, in E. coli exprimiert und aufgereinigt. Es wurde eine Aktivität von 4,2 U·mg-1 in der löslichen Fraktion und 150,3 U·mg-1 nach Reinigung mit einer Affinitätschromatographie erreicht. Vier pflanzliche 13(S)-spezifische HPLs wurden mithilfe einer Literatur- und Datenbanksuche ausgewählt. Die synthetischen Gene wurden kloniert, exprimiert und die entsprechenden Proteine analysiert. Da die Aktivität der Wildtyp-HPLs in voller Länge gering war, wurden die hydrophoben, nicht-konservierten N-terminalen Sequenzen entfernt. Darüber hinaus wurden NusAHPL-Fusionsproteine konstruiert. Dadurch konnte die spezifische Aktivität aller HPLs signifikant erhöht werden. Die N-terminal deletierte HPLCP-N aus Carica papaya (Papaya) zeigte mit 0,85 U·mg-1 in der löslichen Fraktion die höchste Aktivität und wurde daher für weitere Versuche ausgewählt. Eine schnelle Spaltung des Linolsäurehydroperoxids zu 12 Oxo 9(Z) Dodecensäure und Hexanal wurde für HPLCP-N mittels Gaschromatographie nachgewiesen. Die Isomerisierung von 12-Oxo-9(Z)-dodecensäure zu 12-Oxo-10(E)-dodecensäure (Traumatin) konnte durch die Verwendung von gereinigtem HPL anstelle der löslichen Fraktion deutlich reduziert werden. Darüber hinaus wurden sieben bakterielle ω-TAs aktiv exprimiert und mit Affinitätschromatographie aufgereinigt. Es wurde ein gekoppelter photometrischer Assay mit einer Laktatdehydrogenase und NADH entwickelt, der die Aktivität aller Enzyme gegenüber Hexanal, 12-Oxo-9(Z)-Dodecensäure und 12-Oxo-10(E)-Dodecensäure nachwies. Die ω-TA aus Aquitalea denitrificans (TRAD) zeigte die höchste Aktivität mit 1,17 U·mg 1 gegenüber Hexanal, 0,62 U·mg-1 gegenüber dem 9(Z)-Isomer und 0,52 U·mg-1 gegenüber dem 10(E)-Isomer. Zusätzlich wurde die Bildung von 12-Aminododecensäure und Hexylamin als Transaminationsprodukte der Oxosäuren und Hexanal durch Massenspektrometrische Analysen nachgewiesen. Des Weiteren wurden Eintopfreaktionen im kleinen Maßstab für die Synthese von 12 Oxo 9(Z) dodecensäure mit einer Pseudomonas fluorescens Lipase, LOX-1 und HPLCP-N aus linolsäurereichem Distelöl durchgeführt. Hierbei konnte eine Ausbeute von 43 % 12 Oxo 9(Z) Dodecensäure erzielt werden. Außerdem wurden Eintopfreaktionen zur Synthese von 12 Aminododecensäure mit LOX-1, HPLCP-N und TRAD aus Linolsäure durchgeführt, wobei eine Ausbeute von 12 % 12 Aminododecensäure erreicht wurde. Unseres Wissens nach wurden in dieser Arbeit die Enzyme des Oxylipinwegs das erste Mal mit einer ω-TA zur Synthese des Nylon 12 Monomers 12 Aminododecensäure gekoppelt. Dies eröffnet einen neuen Weg zur Gewinnung von Nylon-12 aus C18-reichen Pflanzenölen. In this work, novel enzyme cascades for the synthesis of polymer building blocks 12 oxododecenoic acid and 12 aminododecenoic acid were developed starting from linoleic acid or safflower oil. For this purpose, one soybean lipoxygenase (LOX), four plant hyroperoxide lyases (HPLs) and seven bacterial ω-transaminases (ω-TAs) were cloned, expressed in Escherichia coli and characterized. 13(S)-specific lipoxygenase LOX-1 from Glycine max (soybean), which catalyzes the hydroperoxidation of linoleic acid to 13(S)-hydroperoxyoctadecadienoic acid (13(S)-HPODE) was successfully cloned, expressed in E. coli and purified. An activity of 4.2 U·mg-1 in the soluble fraction and 150.3 U·mg-1 after affinity chromatography purification was achieved. Four plant-derived HPLs with 13(S) specificity were selected from literature and databank searches. The synthetic genes were cloned, expressed and the corresponding proteins were analyzed. Since activity of the full-length HPLs was low, the hydrophobic, unconserved N-terminus were removed. In addition, NusAHPL fusion proteins were constructed. The specific activities of all HPLs were increased significantly. Truncated HPLCP-N from Carica papaya (papaya) showed highest activity with 0.85 U·mg-1 in the soluble fraction and was hence selected for further experiments. A rapid cleavage of linoleic acid hydroperoxide to 12 oxo 9(Z)-dodecenoic acid and hexanal was demonstrated for HPLCP-N by gas chromatography. The isomerization of 12-oxo-9(Z)-dodecenoic acid to 12 oxo-10(E)-dodecenoic acid (traumatin) could be reduced by utilization of purified HPL instead of the soluble fraction. Furthermore, seven bacterial ω-TAs were actively expressed and affinity-purified. A coupled photometric assay with lactate dehydrogenase and NADH was developed, demonstrating activity of all enzymes towards hexanal, 12 oxo 9(Z) dodecenoic acid and 12-oxo-10(E)-dodecenoic acid. ω-TA from Aquitalea denitrificans (TRAD) showed the highest activity with 1.17 U·mg-1 on hexanal, 0.62 U·mg-1 on the 9(Z) isomer and 0.52 U·mg-1 on the 10(E) isomer. In addition, mass spectrometric analysis demonstrated the formation of 12-aminododecenoic acid and hexylamine as transamination products of the oxo acid and hexanal. One-pot reactions were carried out in small scale for the synthesis of 12-oxo-9(Z)-dodecenoic acid with Pseudomonas fluorescens lipase, LOX-1 and HPLCP-N starting from linoleic acid-rich safflower oil. A yield of 43 % 12-oxo-9(Z)-dodecenoic acid was achieved. In addition, one-pot reactions were conducted for the synthesis of 12-aminododecenoic acid using LOX-1, HPLCP-N and TRAD with linoleic acid as substrate. A yield of 12 % of 12-aminododecenoic acid was reached. To our knowledge, in this work, the enzymes of the oxylipin pathway were coupled for the first time with a ω-TA for the synthesis of the nylon-12 monomer 12-aminododecenoic acid. This provides a new route for obtaining nylon-12 from C18-rich plant oils.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	24.07.2023
Dateien geändert am:	24.07.2023
Promotionsantrag am:	15.02.2023
Datum der Promotion:	22.06.2023