Dokument: Overcoming the Blue-Green gap: Engineering tools for cyanobacteria as photoautotrophic chassis organisms

Titel:	Overcoming the Blue-Green gap: Engineering tools for cyanobacteria as photoautotrophic chassis organisms
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62952
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230703-113034-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Behle, Anna [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 55,34 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.06.2023 / geändert 23.06.2023
Beitragende:	Jun.-Prof. Dr. Axmann, Ilka M. [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter] Prof. Dr. Dittmann, Elke [Gutachter]
Stichwörter:	Cyanobacteria, promoters, genetic tools, metabolic engineering, DNA-supercoiling
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In einer sich schnell verändernden Welt sind wir fast täglich mit neuen Herausforderungen konfrontiert. Aktuell sind der Klimawandel, sowie die limiterte Verfügbarkeit von endlichen Rohstoffen, dafür verantwortlich, dass neue Technologien für die Nutzbarkeit von erneuerbaren Energien entwickelt werden. Gleichzeitig wird die Aufgabe, eine ständig wachsende und sich entwickelnde Welt zu ernähren, von der limitierten Nutzbarkeit unserer Agrarflächen für Nutzpflanzen überschattet. Photoautotrophe Organismen wie Cyanobakterien besitzen vielversprechende Qualitäten, die sich für die Lösung einiger dieser Herausforderungen eignen. Allerdings befinden sie sich, verglichen mit bereits im bioindustriellen Markt angewandten heterotrophen Modellorganismen, noch im Anfangsstadium. Damit der Weg hin zu innovativen biotechnologischen Anwendungen mit Cyanobakterien, sowie grundlegender Forschung, geebnet werden kann, müssen gut charakterisierte und vor allem funktionierende genetische Werkzeuge für Cyanobakterien weiterentwickelt und verbessert werden. In dieser Arbeit wurden neue Werkzeuge etabliert, und bereits vorhandene wurden verbessert. Die drei induzierbaren Promotoren, Prha, PvanCC, und PL03, wurden im Hinblick auf ihre Stärke, Dosis-abhängige Antwort, Orthogonalität und Verhalten über die Zeit charakterisiert. Desweiteren wurden die zwei robusteren in einem Projekt zur Produktion des Sesquiterpens Valencen verwendet. Durch induzierbares CRISPRi konnte ein großer Teil der Vorläufermoleküle von den Carotinoiden zum gewollten Produkt gelenkt werden. Dies resultierte in einem Stamm, der in der Lage war 17.6 mg/L Valencen zu produzieren. In einem zweiten Projekt wurden die induzierbaren Promotoren eingesetzt, um gezielt globales DNA-Supercoiling zu entfernen, entweder durch die Herunterregulierung der Gyrase, oder der Überexpression der Topoisomerase I. Dies ermöglichte eine detaillierte Analyse auf molekularer und physiologischer Ebene, sowie eine RNA-Seq Analyse über einen Zeitraum von 10 Tagen, mit hoher zeitlicher Auflösung. Verringerung von Supercoiling resultierte in erhöhten Glykogen- und ATP Werten im Fall der topA Überexpression, sowie Blockierung der Zellteilung, was zu erhöhtem Zellvolumen führte. Mithilfe von RNASeq Analyse konnten diverse funktionielle cluster identifiziert werden, die im engen Zusammenhang mit dem zirkadianen Programm stehen, und eine kooperative Rolle von DNA-Supercoiling während des Übergangs von Dunkelheit ins Licht wird vermutet. Diese Arbeit ist ein wertvoller Beitrag zum cyanobakteriellen Wissenschaftsverband. Die Identifizierung und erfolgreiche Anwendung robuster regulatorischer Werkzeuge wird einen nachhaltigen Einfluss auf zukünftige Arbeiten mit diesen faszinierenden Organismen haben und den Weg für eine neue biotechnologische Revolution ebnen. In a rapidly changing world, we are faced with new challenges to overcome every day. Currently, climate change, as well as the limited availability of finite resources is pushing industries towards the development of technologies that can make use of renewable energy sources. At the same time, the need to feed an ever-growing and -developing world is overshadowed by the limited availability of land suitable for our crops. Photoautotrophic organisms such as cyanobacteria offer promising qualities to mitigate some of these challenges. However, they are still lagging behind compared to heterotrophic model organisms, some of which have already been successfully applied in large scale in the biotechnological industry. To pave the way for innovative biotechnological applications involving cyanobacteria, as well as foundational research that can aid in research of photosynthetic organisms, more wellcharacterized and well-functioning genetic tools need to be developed and improved. In this work, new tools were established, and existing ones were improved. The three inducible promoters Prha, PvanCC, and PL03 were characterized in terms of overall strength, dose-dependent response, orthogonality, and behavior over time. After assessing these tools for their robustness, two of them were further applied towards engineering the model cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 for the heterologous production of the plant sesquiterpene valencene. Use of inducible CRISPR interference enabled rewiring of a significant portion of the precursor pool from the carotenoids towards the desired product, yielding a production strain capable of producing 17.6 mg/L valencene. In a second project, the inducible promoters were used for targeted removal of global DNA-supercoiling by either downregulating gyrase or overexpressing topoisomerase I, enabling the extensive physiological and molecular characterization of a strain with reduced supercoiling capabilities over a period of ten days. This includes an RNA-Seq time-series with high temporal resolution. Reduction of supercoiling resulted in elevated glycogen and ATP levels for the topA overexpression, as well as blockage of cell division, which resulted in an increased cell volume. RNA-Seq analysis revealed functional clusters closely related to the circadian program, suggesting a cooperative role of DNA-supercoiling during the transition between darkness and light. This work is an important contribution to the cyanobacterial research community. The identification and successful application of robust regulatory genetic tools will influence future work on these fascinating organisms and pave the way for a biotechnological revolution.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	03.07.2023
Dateien geändert am:	03.07.2023
Promotionsantrag am:	14.06.2022
Datum der Promotion:	18.11.2022