Dokument: Charakterisierung von Kokultur-Modellen aus Keratinozyten und unrestringierten, somatischen Stammzellen aus Nabelschnurblut

Titel:	Charakterisierung von Kokultur-Modellen aus Keratinozyten und unrestringierten, somatischen Stammzellen aus Nabelschnurblut
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62759
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230531-085808-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Faas, Miriam [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,36 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 25.05.2023 / geändert 25.05.2023
Beitragende:	Univ.-Prof. Dr. med. Dr. med. dent. Kübler, Norbert [Gutachter] Priv.-Doz. Dr. med. Kristin, Julia [Gutachter]
Stichwörter:	Keratinozyt, Nabelschnurblutstammzelle, USSC, Kokultur
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Haut als schützendes Organ gegen Umwelteinflüsse und gleichzeitig stabilisierende Hülle für den Organismus ist durch die Exposition gegenüber ihrer Umgebung häufig von Verletzungen betroffen. Darüber hinaus führen auch Erkrankungen zur Beeinträchtigung der Funktionen, welche die Haut in einem gesunden Körper erfüllt. Gewebe des menschlichen Körpers sind Funktionseinheiten aus mehreren Zellarten, die in unterschiedlich zusammengesetzte extrazelluläre Matrices eingebettet sind. Auch die humane Haut ist aus einer Reihe von Schichten aufgebaut, die sich im Zusammenspiel ihrer Eigenschaften funktionell und strukturell ergänzen und auseinander hervorgehen. Die Etablierung einer Kokultur verschiedener Zelllinien geht mit der Herausforderung einher, die Expressionsbeiträge von Genen, die untersucht werden sollen, jeweils einer der vorhandenen Zelllinien zuzuweisen. Der hier gewählte Ansatz war die Bestimmung dieser Beitragsanteile durch die Verwendung von Keratinozyten und USSCs unterschiedlichen Geschlechts. Um das Verhältnis der gleichbleibenden GAPDHExpression des Gesamtextrakts zu einem ausschließlich in männlichen Zellen exprimierten Marker zugänglich zu machen, wurde die Ubiquitin-spezifische Peptidase 9, die auf dem Y-Chromosom codiert ist, (USP9Y) als konstitutiv exprimierter Marker gewählt. Es gelang der Nachweis, dass beide Zelllinien Beiträge aus ihrem aktiven Stoffwechsel liefern. Die quantitative Realtime PCR ist jedoch für eine Unterscheidung der Linien bei sehr ähnlichen Zellzahlen zur genauen Auflösung der Anteile nicht geeignet. Weiterhin wurden in dieser Arbeit die Expressionsmuster einer Kokultur aus Keratinozyten und USSCs im Hinblick auf die Verfügbarkeit verschiedener Signalproteine untersucht. Dabei wurden die USSCs sowohl als Suspensionskultur als auch in Mikromassenkonstrukten, also Zellagglomeraten aus 60.000 Zellen, jeweils zu einer zweidimensionalen subkonfluenten Kultur von Keratinozyten zugefügt. Es zeigte sich, dass sich die später zugegebenen USSCs jeweils in den freigebliebenen Arealen anheften konnten. Diese Areale wurden, lichtmikroskopisch sichtbar, nur von einer der beiden Linien als Wachstumsfläche genutzt. Von besonderem Interesse waren in der Untersuchung die Signalproteine TGF β2, EGFR, IL1RN, AHNAK und TMEFF1. Hierfür wurden in quantitativen real time PCR-Experimenten die relativen Expressionsverhältnisse untersucht. Wie aus den Array-Analysen deutlich wurde, zeigte sich, dass in der Kokultur die Transkription sowohl der stammzelltypischen als auch der keratinozytentypischen Marker aufrechterhalten blieb. Auch ohne extrazelluläre Matrix, wie im hier untersuchten Kokulturansatz, bleiben die beiden Zelllinien vital. Weitere Untersuchungen sollten zeigen, ob sowohl extrazelluläre Matrixmoleküle als auch andere Zellarten eine stabile Kokultur unterstützen. In its role as the main protective organ against environmental stress and at the same time as a stabilizing covering for the organism, the human skin is often affected by injuries as a consequence of its exposure to external influences. In addition, diseases also lead to an impairment of different functions which are normally assigned to skin in a healthy body. Human skin tissue consists of functional units comprising of several cell types which are embedded in extracellular matrices. The human skin is built from a set of layers which complement each other in functional as well as structural aspects and emerge from one another. The establishment of cocultures consisting of different cell lines is connected to the task of assigning expressions of the genes of interest to a certain cell line within the total extract. In this work the approach to determine contributions to expression levels of different cell lines was to coculture keratinocytes and USSCs of different gender. In order to evaluate the ratio of expression levels from the housekeeping gene of glyceraldehyde dehydrogenase in the total extract in relation to a solely in male cells expressed marker was chosen. The ubiquitin-specific peptidase 9 which is encoded on the Y-chromosome (USP9Y) was detected in the quantitative real time polymerase chain reaction due to its constitutive expression in keratinocytes. Nonetheless this type of analysis is not suitable to determine the exact ratio of the different cell types when they are present in similar quantities. In addition, expression patterns of a coculture consisting of keratinocytes and USSCs were investigated in this study. For these analyses USSCs were added either as a suspension culture or as micromass constructs to a twodimensional subconfluent keratinocyte culture. Micromass is a term which refers to cell agglomerates consisting of 60,000 cells in this study. As a result, from this mode of combining the cultures, the USSCs which had been introduced to the coculture adhered to the unoccupied areas and did not mingle with the keratinocytes as visible in phase contrast microscopy. Of special interest in the gene expression experiments were signaling proteins like transforming growth factor beta (TGF-beta). In quantitative real time PCR experiments relative expression levels were determined. From array analyses of cocultures the findings emerged that within cocultures transcriptions of stem cell as well as keratinocyte markers were continued. These results indicate that in the absence of extracellular matrix as provided in the conducted experiments both cell lines stay intact. Further studies should be carried out in order to determine whether extracellular matrix molecules as well as other cell types to be combined in a stable coculture may enhance tissue-like features.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	31.05.2023
Dateien geändert am:	31.05.2023
Promotionsantrag am:	06.02.2017
Datum der Promotion:	16.05.2023