Dokument: Die Rolle des purinergen Stoffwechsels im Degenerationsprozess von Aortenklappen

Titel:	Die Rolle des purinergen Stoffwechsels im Degenerationsprozess von Aortenklappen
Weiterer Titel:	Role of purinergic signaling in aortic valve degeneration
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62668
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230519-111923-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Leuders, Pia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,36 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.05.2023 / geändert 15.05.2023
Beitragende:	Prof. Dr. med. Akhyari, Payam [Gutachter] Prof. Dr. Kelm, Malte [Gutachter]
Stichwörter:	Aortenklappendegeneration, purinerger Stoffwechsel
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die kalzifizierende Aortenklappenerkrankung (engl. calcific aortic valve disease – CAVD) ist eine fortschreitende Erkrankung, deren Manifestation von leichter Verdickung der Aortenklappe ohne Behinderung des Blutflusses, bis hin zu einer schweren Verkalkung mit starker Beeinträchtigung der Klappenfunktion reicht. CAVD galt lange Zeit als rein passiv degenerativer Prozess. Es gibt jedoch Hinweise dafür, dass es sich um einen aktiv regulierten Prozess handelt, welcher histomorphologisch durch eine Lipoproteinakkumulation, chronische Entzündung und gesteigerte Umbauprozesse innerhalb der extrazellulären Matrix (EZM) charakterisiert ist. Im fortgeschrittenen Stadium stehen kalzifizierende Prozesse im Vordergrund. Es gibt Hinweise dafür, dass eine Dysregulation extrazellulärer purinerger Enzyme die Pathogenese von CAVD mitbeeinflusst. Die Rolle membrangebundener Adenosintriphosphatasen (ATPasen) ist in diesem Kontext noch wenig erforscht. Das Ziel dieser Studie war es, den Einfluss membrangebundener ATPasen im pathophysiologischen Kontext von CAVD zu untersuchen. In CAVD involvierte Prozesse, einschließlich eines EZM Remodelings und einer Biomineralisierung sollten untersucht werden. Ovine valvuläre Interstitialzellen (VIC), sowie Gewebeproben oviner Aortenklappen wurden in einem in vitro Modell unter pro-degenerativen Bedingungen mit ATPase- Inhibitoren (Suramin und Orthovanadat) behandelt. Die kalziumbasierte Mineralisierung wurde mittels Alizarin Rot-Färbung untersucht. Der Kalziumgehalt und die Zellvitalität wurden mittels Kalzium- und Laktat-Dehydrogenase Assay evaluiert. Zur Analyse der Matrixmetalloproteinasen (MMPs) wurde die Natriumdodecylsulfat- Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) basierte Zymographie angewandt. Zur Evaluierung einer möglichen myofibroblastischen Transdifferenzierung wurde die Expression der kontraktilen Filamente Alpha smooth muscle actin (𝛼-SMA) und Vimentin mittles Westernblot untersucht. Die real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR) wurde zur Quantifizierung der Genexpression purinerger Schlüsselenzyme eingesetzt. Histologische Analysen dienten dem Nachweis kalzium- oder phosphatbasierter Mineralisierung mittels Alizarin Rot- oder von-Kossa-Färbung. Movat’s Pentachrom- und Hämatoxylin & Eosin-Färbungen wurden zur Untersuchung von Veränderungen der EZM eingesetzt. Die Inhibition von ATPasen führte zu einer verstärkten Biomineralisierung und einem verstärkten Umbau der EZM in vitro. Eine kalzium-, und phosphatbasierte Mineralisierung konnte verstärkt nachgewiesen werden. MMPs waren hochreguliert und die Expression von myofibroblastischen Markern war verändert. Schlüsselenzyme des purinergen Stoffwechsels waren unterschiedlich reguliert. Die Regulation purinerger Enzyme auf Genebene bei CAVD ist komplex. In der Vergangenheit wurden unterschiedliche Wirkungen einer purinergen Rezeptoraktivierung auf die Pathophysiologie von CAVD berichtet. Die Ergebnisse müssen in weiteren detaillierteren Modellen bestätigt werden. Unspezifische Nebenwirkungen der Substanzen limitieren die Aussagekraft der Ergebnisse. Die Studie liefert wichtige Hinweise dafür, dass Enzyme des purinergen Stoffwechsels in Umbauprozesse der EZM und kalzifizierende Prozesse bei CAVD involviert sind. Die Regulierung von ATP konvertierenden Enzymen könnte in Zukunft therapeutische Ansätze für eine pharmakotherapeutische Beeinflussung von CAVD liefern. Es sind jedoch weitere Untersuchungen notwendig, um die Ergebnisse zu bestätigen. Calcific aortic valve disease (CAVD) is a progressive disease beginning with small alterations at the level of cell morphology and function, as well as alterations of the extracellular matrix, focal leaflet thickening and later macroscopic changes such as nodular calcific accumulations leading to functional impairment of the valve. For a long time CAVD was considered to be a passive and mainly degenerative disease, but there is increasing evidence that it is an actively regulated process involving lipoprotein accumulation, chronic inflammation and actively regulated changes within the extracellular matrix. Adenosintriphosphatases (ATPases) are a class of enzymes that catalyze the decomposition of ATP into ADP and a free phosphate ion. It has been shown that key enzymes of the purinergic signaling system profoundly affect the degeneration of the aortic valve, whereas the role of related ATPases is still poorly understood. The aim of this study was to analyze the role of transmembrane ATPases in the pathopysiology of CAVD. Calcification associated processes were evaluated including extracellular matrix (ECM) remodeling, quantification of biomineralization and purinergic as well as myofibroblastic gene expression. Ovine valvular interstitial cells (VIC), as well as biopsies of ovine aortic valve cusps were cultured in vitro under pro-degenerative conditions and treated with ATPase inhibitors (suramine and orthovanadate). Calcium based mineralization was evaluated by Alizarin Red staining. Calcium content and cell vitality was evaluated using calcium and lactate dehydrogenase assays. Sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS PAGE) based zymography of supernatants was performed to analyze the activity of involved matrixmetalloproteinases (MMPs) in the ECM remodeling process. The expression of alpha smooth muscle actin (𝛼-SMA) and vimentin were quantified by Westernblot analysis. Key enzymes of the extracellular purinergic signaling were analyzed using real-time quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Histological analysis of either calcium- or phosphate- based mineralization was carried out by Alizarin Red- and von-Kossa staining. Movat’s Pentachrom staining and Haematoxylin and Eosin (H&E) staining were used to detect changes in the composition and structure of the ECM. Our main findings are that the inhibition of transmembrane ATPases increased in vitro biomineralization of aortic valve tissue and VIC cultures, enhanced remodeling of the ECM with increased MMP secretion and triggered myofibroblastic differentiation. Further, both ATPase inhibitors have effects on the expression of key enzymes of the purinergic signaling system. These findings suggest that a dysregulation of transmembrane ATPases leads to osteoblastic differentiation of VIC and enhanced biomineralization of aortic valve tissue. Specific purinergic gene regulation in the context of CAVD is complex. Various effects of purinergic receptors and related downstream effects in the aortic valve tissue have been reportet in the past. In the future more elaborated and detailed models are necessary to confirm our results. The findings of the study are limited due to the nonspecific binding of the herein applied ATPase inhibitors. Both suramine and orthovanadate have side effects and cytotoxic potential. This study provides further evidence that enzymes of the purinergic signaling system play a pivotal role in CAVD. The inhibition of ATPases influences biomineralization in vitro. Regulation of ATP-conversing enzymes may be a promising approach to alter CAVD progression, but further investigations are necessary.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	19.05.2023
Dateien geändert am:	19.05.2023
Promotionsantrag am:	15.08.2022
Datum der Promotion:	09.05.2023