Dokument: Entwicklung einer CAR-T-Zelltherapie zur Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses (HNSCC)
| Titel: | Entwicklung einer CAR-T-Zelltherapie zur Behandlung von Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses (HNSCC) | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62625 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230517-102615-9 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Haist, Corinna [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. med. Hanenberg, Helmut [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | CAR, T-Zelle, CD44v6, EGFR, HNSCC | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Gen- und immuntherapeutische Anwendungen rücken zunehmend in den Mittelpunkt der modernen Onkologie und werden immer häufiger zur Behandlung von Patienten eingesetzt, bei denen die Standardtherapie versagt hat. Insbesondere autologe T-Zellen, die chimäre Antigenrezeptoren (CARs) exprimieren, zeigen eine vielversprechende anti-tumorale Wirksamkeit bei Patienten mit CD19+ B-Zell-Neoplasien, weshalb es für die diese Erkrankung bereits sechs zugelassene CAR-T-Zelltherapien gibt.
Bislang konnte der erstaunliche Erfolg der CAR-T-Zelltherapie bei B-Zell-Malignomen noch nicht auf die Behandlung solider Tumore übertragen werden. Denn eine der größten Herausforderungen bei soliden Krebserkrankungen ist die Heterogenität der Zielantigenexpression auf den Tumorzellen, die häufig zum Entkommen/Überleben antigen negativer Tumorzellen nach der Verabreichung der CAR-T-Zellen führt. Aus diesem Grund verfolgte ein Ziel dieser Dissertation, hochaffine CARs gegen Zielantigene zu entwickeln, die auf Plattenepithelkarzinomen des Kopfes und Halses (HNSCC) möglichst homogen exprimiert werden. Der epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR) und die CD44-Variante 6, eine onkogene Spleißvariante von CD44, wurden als solche Zielkandidaten identifiziert, da sie auf der überwiegenden Mehrheit der getesteten HNSCC-Zelllinien exprimiert wurden. CARs gegen beide Antigene, die auf klinisch verwendeten hochaffinen einkettigen variablen Fragmenten (scFvs) der monoklonalen Antikörper Cetuximab bzw. BIWA8 basieren, wurden in lentiviralen Vektoren etabliert und ihre Funktionalität sowie ihre Spezifität an Zellen aus verschiedenen Tumorentitäten validiert. Jedoch sind die immunsuppressiven Effekte der Tumormikroumgebung (TME) von soliden Tumoren ein weiteres großes Problem für die CAR-T-Zelltherapie, da die TME häufig die Immuneffektorzellen des Patienten inhibiert und ihre Zytotoxizität dadurch erheblich einschränkt. Deshalb wurde in dieser Arbeit versucht, maligne Zellen durch epigenetische Modulation für die CAR-T-Zelltherapie zu sensibilisieren. Als Beispiele für Proof-of-Principle-Studien wurden Plattenepithelkarzinom-Zelllinien der Blase mit zwei epigenetischen Inhibitoren, dem DNA-Methyltransferase-Inhibitor (DNMTi) Decitabin und dem Histon-Deacetylase-Inhibitor (HDACi) Romidepsin, vorbehandelt und anschließend mit EGFR- und CD44v6-CAR-T-Zellen koinkubiert. Diese epigenetische Vorbehandlung wirkte sich stark auf das Überleben und die Apoptose der Tumorzellen aus: Decitabin verbesserte und Romidepsin reduzierte die lytische Aktivität der CAR-T-Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen. Genexpressionsanalysen mit anschließender Validierung zeigten eine Korrelation zwischen der Zytotoxizität der CAR-T-Zellen und der Expression von zwei Mitgliedern der BCL2 Genfamilie, wobei eine Erhöhung der BID- und ein Rückgang der BCL2L1-Expression mit einer effektiveren Lyse der Tumorzellen einherging. Alle in dieser Arbeit genutzten CAR-Konstrukte erhielten zusätzlich eine neuartige, aus humanem CD34 abgeleitete C6-hinge, die von dem CD34 Antikörper Qbend-10 gebunden werden kann. Somit war es möglich CAR-T-Zellen sowohl direkt im Durchflusszytometer zu detektieren als auch mit Hilfe des magnetisch aktivierten Zellsortiersystems (MACS) von Miltenyi Biotec anzureichern; diese Verfahren können wahrscheinlich unter Einhaltung der good manufacturing practice standards durchgeführt werden. Zu betonen ist, dass die zusätzlichen Funktionen der C6-hinge keine Auswirkungen auf die Zytotoxizität der CAR T Zellen in vitro und in vivo in Leukämiemodellen bei Mäusen hatten. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit erfolgreich hochaffine CAR Konstrukte gegen zwei auf soliden Tumorzellen exprimierte Schlüsselantigene EGFR und CD44v6 etabliert, um CAR-positive T-Zellen, die die neuartige hinge-Region enthalten, effizient anzureichern und gleichzeitig solide Tumorzellen für die CAR-T-Zelltherapie durch die Vorbehandlung mit epigenetischen Inhibitoren zu sensibilisieren.Gene and immunotherapeutic approaches are increasingly becoming the focus of modern oncology and are being applied more and more frequently in the therapy of patients failing standard treatment. In particular, autologous T-cells expressing chimeric antigen receptors (CARs) show promising anti-tumor efficacy in patients with CD19+ B-cell neoplasms. Currently, there are six approved CAR T-cell therapies, all against B-cell neoplasms. To date, the amazing success of CAR T-cell therapy for B-cell malignancies could not be reproduced in the treatment of solid tumors. One of the major challenges in solid cancers is the heterogeneity of target antigen expression levels on tumor cells, which often leads to escape/survival of antigen-negative tumor cells after CAR T-cell administration. Therefore, one goal of this dissertation was to develop high-affinity CARs against target antigens expressed as homogeneously as possible on head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs). The epidermal growth factor receptor (EGFR) and the CD44 variant 6, an oncogenic splice variant of CD44, were identified as such target candidates, as they were expressed on the vast majority of the HNSCC cell lines tested. CARs against both antigens, based on clinically used high-affinity single chain variable fragments (scFvs) of the monoclonal antibodies cetuximab and BIWA8, respectively, were established in lentiviral vectors and the specificity and functionality of the CAR constructs validated on cells from different tumor entities. The immunosuppressive effects of the tumor microenvironment (TME) are another major problem for CAR T-cell therapy of solid tumors, as the TME often inhibits the patient's immune effector cells and significantly limits their cytotoxicity. Consequently, this work attempted to sensitize malignant cells to CAR T-cell therapy by epigenetic modulation of gene expression. As examples for proof-of-principle studies, squamous cell carcinoma cell lines of the bladder were pre-treated with two epigenetic inhibitors, the DNA methyltransferase inhibitor (DNMTi) decitabine and the histone deacetylase inhibitor (HDACi) romidepsin, and then incubated with EGFR and CD44v6 CAR T-cells. This epigenetic pre-treatment strongly affected tumor cell survival and apoptosis in the co-cultures: Decitabine improved and romidepsi reduced the lytic capacity of the CAR T-cells in comparison to the untreated control cells. Gene expression analyses with subsequent validation revealed a correlation of the CAR T-cell cytotoxicity with the expression of two members of the BCL2 gene family, an increase in BID and a decrease in BCL2L1 expression with a more effective tumor cell lysis. All CAR constructs used in this work contained a novel human CD34-derived C6-hinge, which can be bound by the CD34 antibody Qbend-10. This made it very easy to detect CAR T-cells directly in the flow cytometer and to enrich them via the magnetic-activated cell sorting (MACS) microbeads system from Miltenyi Biotec; these procedures can probably be performed in compliance with good manufacturing practice standards. Importantly, these additional C6-hinge functions had no effect on CAR T-cell function and cytotoxicity in vitro and in vivo in leukemia models in mice. In this thesis, high affinity CAR constructs against key antigens expressed on solid tumor cells, EGFR and CD44v6, were successfully established to efficiently enrich transduced CAR-T cells with a novel hinge region, and at the same time make solid tumor cells more sensitive towards CAR T-cell therapy by pre-treatment with epigenetic inhibitors. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 17.05.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 17.05.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 31.05.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 12.12.2022 |
