Dokument: Die Regulation der Insulinsignalkaskade in aortalen valvulären Interstitialzellen unter diabetischer Stoffwechsellage

Titel:	Die Regulation der Insulinsignalkaskade in aortalen valvulären Interstitialzellen unter diabetischer Stoffwechsellage
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62624
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230519-085042-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Krug, Hannah Viviana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,56 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.05.2023 / geändert 10.05.2023
Beitragende:	Prof. Dr. med. Payam Akhyari [Gutachter] Prof. Dr. Margriet Ouwens [Gutachter]
Stichwörter:	Diabetes, Aortenklappe, Valvuläre Interstitialzellen, Rapamycin, MTOR, ERK, U0126, Seahorse Assay
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die degenerative Aortenklappenerkrankung (CAVD) ist ein häufiges Erkrankungsbild in der westlichen Welt. Im Degenerationsprozess werden valvuläre Interstitialzellen (VIC) aktiviert und tragen somit zu progressiver Fibrosierung und Kalzifikation bei. Diabetes mellitus Typ 2 erhöht neben weiteren kardiovaskulären Risikofaktoren das Risiko für die Entwicklung einer CAVD, wobei die zugrunde liegenden Mechanismen Gegenstand aktueller Forschung sind. Es konnte bereits gezeigt werden, dass Hyperglykämie und -insulinämie inhibierend auf den AKT-Signalweg wirken und eine Insulinresistenz in VIC induzieren. Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die der AKT nachgeschalteten Signalmoleküle MTOR und FOXO1 sowie ERK 42/44 aus dem MAPK-Signalweg auf ihre funktionelle Rolle im Rahmen degenerativer Veränderungen durch diabetische Bedingungen in VIC zu untersuchen. Darüber hinaus wird der Metabolismus von VIC unter diabetischen Bedingungen charakterisiert. Für die Versuche wurden primäre VIC aus der Aortenklappe oviner Herzen isoliert und in einem zweidimensionalen in vitro Zellkulturmodell über sechs Tage mit hyperglykämen und hyperinsulinämen Bedingungen inkubiert. Darüber hinaus wurden der PI3K- und der MAPK-Signalweg über die spezifischen Inhibitoren Rapamycin (gegen MTOR) und U0126 (gegen ERK 42/44) blockiert. Zelllysate sowie Zellkultur-Überstände wurden anschließend proteinbiochemisch und molekularbiologisch in Hinblick auf beteiligte Signalwege sowie auf die Expression von Markern der VIC-Differenzierung und des Matrixumbaus analysiert. Auswirkungen auf metabolische Prozesse unter den Behandlungsbedingungen wurden mithilfe eines SeahorseXFe96 Analysiergerätes untersucht. Diabetische Bedingungen reduzieren die Phosphorylierung von MTOR im PI3K-Signalweg, während FOXO1 und ERK 42/44 weniger ausgeprägt reguliert werden. Rapamycin reduziert die Phosphorylierung von MTOR signifikant in allen Behandlungsgruppen, während U0126 die Phosphorylierung von ERK 42/44 nur in Abwesenheit von Insulin signifikant inhibiert. Beide Inhibitoren führen jedoch dazu, dass die Genexpression verschiedener Matrixproteine wie Dekorin, Biglykan sowie Matrix-Metalloproteinase-2 auf ein konstantes Level gebracht wird, während die Expression dieser Marker unter diabetischen Bedingungen hochreguliert ist. Die Analyse des Metabolismus im Seahorse-Assay zeigt eine Aktivierung durch die diabetischen Bedingungen, wobei der größte Anstieg unter der Kombinationsbehandlung von Hyperglykämie mit Hyperinsulinämie zu verzeichnen ist. Darüber hinaus zeigt sich unter Restriktion auf verschiedene Energiequellen eine Abhängigkeit von Glukose, insbesondere vermehrt unter diabetischen Bedingungen. Hyperinsulinämie führt in VIC zu einem starken Effekt in Bezug auf die Aktivität von MTOR, aber weniger von FOXO1 und ERK 42/44. Eine Inhibition des MTOR-Signalwegs durch Rapamycin unterdrückt die mitogene Aktivität der Insulinsignalkaskade. Dieser Einfluss spiegelt sich auch in der Genexpression insbesondere extrazellulärer Matrixproteine wider, sodass anzunehmen ist, dass die MTOR-Signalkaskade an manchen dieser Prozesse beteiligt ist. Somit könnte der Inhibitor Rapamycin potenziell protektiv auf die Effekte wirken, welche diabetische Bedingungen im Rahmen der Entwicklung einer CAVD erwirken. Andere Komponenten der VIC-Differenzierung und des Matrixumbaus scheinen aber auch durch alternative Signalwege reguliert zu sein, sodass die Mechanismen über den Einfluss von Diabetes mellitus auf die Entwicklung einer CAVD Gegenstand zukünftiger Forschung sein werden. Calcific aortic valve disease (CAVD) is a common disease in Western society. During valvular degeneration valvular interstitial cells (VIC) are activated leading to progressive fibrosis and calcification. Type 2 diabetes mellitus, in addition to other cardiovascular risk factors, increases the risk of developing CAVD, whereby underlying molecular mechanisms are currently an active field of research. It has recently been shown that hyperglycemia and hyperinsulinemia inhibit AKT signaling and induce insulin resistance in VIC. The present work aims to investigate the functional roles of the signaling molecules downstream of AKT, MTOR and FOXO1, as well as ERK 42/44 from the MAPK pathway during the degeneration process induced by diabetic conditions in VIC. Additionally, the metabolism of VIC under diabetic conditions is characterized. Therefore, primary aortic VIC were isolated from ovine hearts and incubated in a two dimensional in vitro cell culture for 6 days under hyperglycemic and hyperinsulinemic conditions. Rapamycin (against MTOR) and U0126 (against ERK 42/44) were applied as specific inhibitors in the PI3K and in the MAPK pathway. Cell lysates as well as cell culture supernatants were subsequently analyzed by protein biochemical analysis and molecular biological analysis with regard to the involved signaling pathways as well as expression of markers of VIC differentiation and matrix remodeling. Effects on metabolic processes under diabetic conditions were examined using a SeahorseXFe96 Analyzer. Diabetic conditions reduce phosphorylation of MTOR in the PI3K pathway, whereas FOXO1 and ERK 42/44 are less regulated. Treament with Rapamycin significantly reduces phosphorylation of MTOR in all treatment groups, whereas treatment with U0126 only reduces phosphorylation of ERK 42/44 in the absence of insulin. Both inhibitors keep different matrix proteins, like decorin, biglycan and matrix metalloproteinase 2, on a constant level, whereas diabetic conditions lead to an increased expression of these matrix proteins. The Seahorse assay shows an activated metabolism unter diabetic conditions with the greatest increase under the combination of both hyperglycemia and hyperinsulinemia. Moreover, restriction of different energy sources shows a dependence of VIC on glucose especially under diabetic conditions. Hyperinsulinemia leads to a strong regulation with regard to the activity of MTOR, but less strongly of FOXO1 and ERK 42/44. Inhibition of the MTOR pathway through Rapamycin treatment supresses the mitogenic activity of the insulin signaling cascade. Additionally, Rapamycin regulates gene expression of extracellular matrix proteins, suggesting an involvement of the MTOR signaling cascade in these processes. In conclusion, MTOR might take part in some processes regarding matrix remodeling in VIC. Therefore, the inhibitor Rapamycin could potentially prevent effects of diabetic conditions in the development of CAVD. Further components of VIC differentiation and matrix remodeling also appear to be regulated through alternative signaling pathways. Thus, the mechanisms of the influence of diabetic conditions on the development of CAVD will be a subject of further research.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	19.05.2023
Dateien geändert am:	19.05.2023
Promotionsantrag am:	31.08.2022
Datum der Promotion:	09.05.2023