Dokument: Extrazelluläre Matrixsynthese glomerulärer Zellen in vitro

Titel:	Extrazelluläre Matrixsynthese glomerulärer Zellen in vitro
Weiterer Titel:	Extracellular matrix synthesis of glomerular cells in vitro
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62468
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230428-083246-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kaufmann, Ernest [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,53 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 24.04.2023 / geändert 24.04.2023
Beitragende:	Prof. Dr. med. Lorenz Sellin [Gutachter] Prof. Dr. Lanzman, Rotem [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Proteinurie ist neben einer Hypoproteinämie, peripheren Ödemen und Hyperlipoproteinämie eines der Kriterien für die Diagnose eines nephroti-schen Syndroms. Meist besteht die Proteinurie überwiegend aus einer Al-buminurie. Ein solcher Verlust von Albumin ist dabei der stärkste Prädiktor für das Auftreten von Erkrankungen wie Herzinfarkten und Schlaganfällen (1). Bei Schädigung des glomerulären Filters, welcher aus fenestriertem Endothel, der glomerulären Basalmembran (GBM) und den Podozyten mit ihrer Schlitz-membran besteht, kommt es zu solch einer Albuminurie. Die Ursachen für ei-ne derartige Schädigung sind vielfältig und reichen von erworbenen Schäden bis zu angeborenen Gendefekten für Proteine des glomerulären Filters. Eines dieser Proteine ist das Glomerular epithelial Protein 1 (GLEPP1). Patienten mit einer GLEPP1-Defizienz entwickeln schon im Kindesalter ein idiopathisches nephrotisches Syndrom. GLEPP1 ist eine Rezeptortyrosinkinase in der Podozytenmembran, dessen genaue Funktion bisher nicht bekannt ist. Die eigene Arbeitsgruppe konnte zeigen, dass alternde GLEPP1-KO-Mäuse morphologische Veränderungen im Sinne von subpodozytären Verbreiterungen der GBM aufweisen. Auch die Zusammensetzung der Hauptkomponente der GBM, des Kollagens-IV zeigt bei einem GLEPP1 knockout ein embryonales Muster (Kollagen Typ IV α1α2α1). (Die embryonalen Kollagen-Ketten werden dabei von Podozyten, wie auch von Endothelzellen produziert, während das adulte Kollagen-IV (α3,4,5) nur von Podozyten gebildet werden kann.) In dieser Doktorarbeit wurde die extrazelluläre Matrixsynthese von glomerulä-ren Zellen in primärer Zellkultur untersucht. Hierfür wurde ein homozygotes GLEPP1-KO-Mausmodell (mit genetischem 129P3/J-Hintergrund) verwendet und im Alter von 4 und 10 Monaten mit Wildtyp-Mäusen verglichen. Für die Untersuchungen wurden Glomeruli mittels Dynabead-Methode isoliert und in primärer Zellkultur aufgenommen. Die aussprossenden glomerulären Zellen wurden anschließend mittels qPCR anhand von spezifischen Zellmarkern charakterisiert. Hierbei zeigte sich eine heterogene Mischkultur aus Po-dozyten, Endothelzellen und auch Mesangialzellen. Die Zellen wurden weiter kultiviert und es wurde mit eigens modifizierten Protokollen die sezernierte extrazelluläre Matrix isoliert. Der Fokus lag hierbei auf den Hauptkomponen-ten der GBM; den Kollagen Typ IV-Ketten (α 1,2,3,5) und dem Laminin (α1). Die Isolate wurden enzymatisch verdaut und auf Proteinebene im Westernblot untersucht. Es zeigten sich sehr geringe nachweisbare Proteinmengen, welche im Vergleich zwischen WT und KO keine signifikanten Unterschiede zeigten. Die Kultivierung von 10 Monate alten Mausglomeruli zeigte unabhängig vom Genotyp keine adäquate extrazelluläre Matrix-Protein-Produktion und war dadurch weiteren Untersuchungen nicht zugänglich. Zur Kontrolle der Proteinuntersuchungen wurde aus den kultivierten Zellen RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben, welche anschließend qPCR-Untersuchungen zugeführt wurden. Hier zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen GLEPP1 WT und KO, und auch keiner zwischen den beiden Altersgruppen. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass glomeruläre Zellen in vitro eine extrazelluläre Matrix sezernieren. Die extrazelluläre Matrix unterscheidet sich in vitro von den in vivo beobachteten Veränderungen. Dies zeigte sich sowohl auf Protein-Ebene als auch auf der Transkriptions-Ebene. Da sich bei einer Mischkultur die Sekretion einiger Proteine und der RNA nicht eindeutig einer Zellart zuordnen lässt, wären ggf. noch Untersuchungen mit primären Zellisolaten von Podozyten und Endothelzellen möglich. Proteinuria is one of the criteria for the diagnosis of the nephrotic syndrome, along with hypoproteinemia, peripheral edema, and hyperlipoproteinemia. In most cases, proteinuria consists predominantly of albuminuria. Such loss of albumin is the strongest predictor for the occurrence of diseases such as myo-cardial infarction and stroke (1). Damage to the glomerular filter, which consists of the fenestrated endothelium, the glomerular basement membrane (GBM) and the podocytes with their slit membrane, results in albuminuria. The reasons for this structural damage are manifold and range from acquired damage to congenital genetic defects for glomerular filter proteins. One of these proteins is the glomerular epithelial protein 1 (GLEPP1). Patients with GLEPP1 deficiency develop idiopathic ne-phrotic syndrome in childhood. GLEPP1 is a receptor tyrosine kinase in the podocyte membrane, where the exact function is not yet known. Our own research group could show that aging GLEPP1-KO mice show morphological changes such as subpodocytic broad-ening of the GBM. Also, the composition of the major component of the GBM, collagen IV, shows an embryonic pattern (collagen type IV α1α2α1) in a GLEPP1 knockout. (The embryonic collagen chains are produced by podo-cytes, as well as by endothelial cells, whereas adult collagen IV (α3,4,5) can only be produced by podocytes). In this doctoral thesis, the extracellular matrix synthesis of glomerular cells was studied in primary cell culture. For this purpose, a homozygous GLEPP1-KO mouse model (with genetic 129P3/J background) was used and compared with wild-type mice at 4 and 10 months of age. For the studies, glomeruli were isolated by Dynabead method and transferred in primary cell culture. The sprouting glomerular cells were subsequently characterized by qPCR using specific cell markers. This revealed a heteroge-neous mixed culture of podocytes, endothelial cells, and also mesangial cells. The cells were further cultured and the secreted extracellular matrix was iso-lated using specially modified protocols. The focus here was on the major components of the GBM; collagen type IV chains (α 1,2,3,5) and laminin (α1). The isolates were enzymatically digested and analyzed at protein level by Western blot. Very low detectable protein levels were found, which showed no significant differences when comparing WT and KO. The cultivation of 10-month-old mouse glomeruli did not show adequate extracellular matrix protein production independent of the genotype and was therefore not accessible to further investigations. As a control for the protein assays, RNA was isolated from the cultured cells and transcribed into cDNA, which was subsequently subjected to qPCR assays. There was no significant difference between GLEPP1 WT and KO, nor between the two age groups. In conclusion, glomerular cells were shown to secrete an extracellular matrix in vitro. The extra-cellular matrix in vitro differs from the changes observed in vivo. This was evident at both the protein level and the transcriptional level. Since in a mixed culture the secretion of some proteins and the RNA cannot be clearly assigned to a cell type, studies with primary cell isolates of podocytes and endothelial cells might still be possible.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	28.04.2023
Dateien geändert am:	28.04.2023
Promotionsantrag am:	23.11.2022
Datum der Promotion:	20.04.2023