Dokument: Catalytically-active Inclusion Bodies and Ferritin-based aggregates for Biotechnology

Titel:	Catalytically-active Inclusion Bodies and Ferritin-based aggregates for Biotechnology
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62433
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230419-104258-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Ölcücü, Gizem [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 31,91 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.04.2023 / geändert 17.04.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In the last decades, pollution, deforestation and global warming caused by human influence have prompted the urgent search for greener industrial processes that minimize further harm to our environment. To this end, green processes utilizing biocatalysts emerged as a viable alternative to classical chemical catalyst driven processes in chemical industries. Enzymes as renewable catalysts, can be produced sustainably, and offer additional benefits from the performance standpoint due to their excellent selectivities and high efficiencies. In industry, enzymes are commonly used in immobilized form, i.e. achieved by binding or adsorbing enzymes to various carriers to allow their reuse and recycling. Widespread incorporation of enzymes within the chemical industry, however, remains largely limited due to their high production costs, as well as drawbacks of current immobilization strategies, such as the necessity of laborious and expensive preparation steps. In the last years, so-called in vivo enzyme immobilization strategies that forego the use of carriers and combine enzyme overproduction and immobilization of enzymes in a single step have started to emerge. Within this framework, catalytically-active inclusion bodies (CatIBs), where target proteins are rationally localized within intracellular proteinaceous aggregates called inclusion bodies (IBs), serve as a promising alternative for enzyme immobilization. Relying on the fusion of genes encoding a CatIB inducing tag and the target gene, followed by overexpression of the gene fusion in a suitable host under the right conditions, CatIBs of the target protein can be easily produced and recovered from the cell lysate, and can be directly used for catalysis. The CatIB strategy is cheap, simple, and widely applicable, evidenced by the numerous proteins of varying complexity being successfully immobilized as CatIBs to date. In this PhD thesis, the CatIB strategy was extended by the utilization of three short, synthetic peptide tags as CatIB inducing elements, namely 18AWT, L6KD and GFIL8. Various fusion strategies were implemented, which included variation of the fusion terminus as well as linker iterations, in order to provide an in depth understanding of the design principles that are imperative for the production of highly active and stable CatIBs. The targets for immobilization included industrially relevant enzymes such as alcohol dehydrogenase from Ralstonia sp. (RADH) and lipase A from Bacillus subtilis (BsLA), as well as the red fluorescent protein mCherry. Superior properties displayed by certain BsLA and RADH CatIBs were demonstrated, as their very high activity and production yields ensured that these CatIBs perform significantly better, even when compared to soluble enzymes. Furthermore, the excellent stability of CatIBs allowed their use in flow chemistry for the first time. Characterization of numerous CatIB producers revealed that the industrially relevant properties of CatIBs are highly dependent on the utilization of the optimal CatIB tag at the optimal terminus, which is variable depending on the target protein. In addition, a novel in vivo immobilization strategy was established to generate magnetic protein aggregates (MPAs), based on a fusion protein consisting of the yellow fluorescent protein citrine, and the iron storage protein ferritin. Ferritin variants, including a mutant with increased magnetic properties, were generated and tested to produce MPAs with the most desirable properties. To this end, the gene fusions were overexpressed in Escherichia coli and the immobilizates could be obtained from the cell lysate via centrifugation in a similar manner to CatIBs. The lysates containing MPAs were shown to be magnetic, evidenced by their attraction to permanent neodymium magnets, and this property enabled their purification using magnetic columns. Furthermore, catalytically-active magnetic protein aggregates (CatMPAs) could be generated by employing a biological bait-prey strategy to immobilize RADH, by post-translationally linking RADH to MPAs. Lastly, the rapidly growing field of in vivo enzyme immobilization necessitated an overview over the state-of-the-art, therefore several literature reviews as well as a book chapter were prepared and included within the framework of this PhD thesis. These encompassed an overview over various alternative in vivo immobilization methods, the flow chemistry applications of immobilized enzymes, and strategies, advantages, drawbacks, applications and complete wet lab methodology related to the production and characterization of CatIBs. In conclusion, the use of green biocatalysts obtained with optimized in vivo immobilization protocols is crucial for the widespread acceptance of biocatalysis in synthetic chemistry and industry. Therefore, the development of new immobilization methods and the improvement of existing ones, as achieved here as part of this PhD thesis, is expected to provide numerous benefits for the next generation of industry, economy, and the environment alike. In den letzten Jahrzehnten haben Umweltverschmutzung, Abholzung der Wälder und die durch den Menschen verursachte globale Erwärmung dazu geführt, nachumweltfreundlicheren Verfahren zu suchen, die unsere Umwelt so wenig wie möglich belasten. In der chemischen Industrie haben sich hierbei Prozesse unter Verwendung von Biokatalysatoren als praktikable, umweltfreundliche Alternative zu klassischen von chemischen Katalysatoren getriebenen Prozessen herausgestellt. Enzyme als erneuerbare Katalysatoren können nachhaltig produziert werden und besitzen zudem eine herausragende Selektivität und hohen Effizienz. In der Industrie werden Enzyme häufig in immobilisierter Form verwendet. Dies geschieht z.B. durch Bindung oder Adsorption an verschiedene Träger, wodurch die Wiederverwertung der Katalysatoren möglich wird. Der breite Einsatz von Enzymen in der chemischen Industrie ist jedoch aufgrund ihrer aufwendigen und kostenintensiven Produktion und Immobilisierung, nach wie vor stark eingeschränkt. In den letzten Jahren wurden sogenannte in vivo Enzym-Immobilisierungsstrategien entwickelt, die ohne Träger auskommen und Enzymproduktion und Immobilisierung in einem einzigen Schritt ermöglichen. Hierbei sind insbesondere katalytisch aktive Einschlusskörper (Englisch: catalytically active inclusion bodies; CatIBs), bei denen Zielproteine rational in intrazellulären Proteinaggregaten, den sogenannten Inclusion Bodies (IBs), eingelagertwerden, eine vielversprechende Alternative für die Immobilisierung von Enzymen. Durch die Fusion von Genen, die für einen CatIB-induzierenden Tag und das Zielgen kodieren, und die anschließende Überexpression dieser Genfusionen in einem geeigneten Wirt unter den richtigen Bedingungen, können CatIBs des Zielproteins leicht hergestellt und aus dem Zelllysat gewonnen und direkt zur Katalyse verwendet werden. Die CatIB-Strategie ist billig, einfach und weithin anwendbar, wie die große Zahl an Zielproteinen unterschiedlicher Komplexität zeigt, die bisher erfolgreich als CatIBs immobilisiert wurden. In dieser Doktorarbeit wurde die CatIB-Strategie durch die Verwendung von drei kurzen, synthetischen Peptid-Tags als CatIB-Tags, nämlich 18AWT, L6KD und GFIL8, erweitert. Es wurden verschiedene Fusionsstrategien implementiert, die sowohl Variationen des Fusionsterminus als auch Iterationen des Linkers beinhalteten, um ein besseres Verständnis der Designprinzipien zu erlangen, die für die Produktion von hochaktiven und stabilen CatIBs unerlässlich sind. Zu den Zielproteinen gehörten industriell relevante Enzyme wie die Alkoholdehydrogenase aus Ralstonia sp. (RADH) und die Lipase A aus Bacillus subtilis (BsLA) sowie das rot fluoreszierende Protein mCherry. Für einige RADH und BsLA CatIB Varianten konnten, im Vergleich zu den entsprechenden gereinigten, löslichen Enzymen, herausragende Eigenschaften wie hohe Aktivitäten und Produktionsausbeuten nachgewiesen werden. Darüber hinaus ermöglichte die hohe Stabilität der CatIBs zum ersten Mal eine Verwendung in der Flusschemie. Die Charakterisierung zahlreicher CatIB-Produzenten zeigte, dass die industriell relevanten Eigenschaften von CatIBs in hohem Maße von der Verwendung des optimalen CatIB-Tags am optimalen Terminus abhängen, der sich jedoch je nach Zielprotein unterscheiden kann. Darüber hinaus wurde eine neue in vivo Immobilisierungsstrategie zur Gewinnung magnetischer Proteinaggregate (MPAs) entwickelt, die auf einem Fusionsprotein des gelb fluoreszierenden Proteins Citrin und dem Eisenspeicherprotein Ferritin basiert. Ferritin-Varianten, einschließlich einer Mutante mit verbesserten magnetischen Eigenschaften, wurden erzeugt und getestet, um MPAs mit geeigneten Eigenschaften herzustellen. Zu diesem Zweck wurden die entsprechenden Genfusionen in Escherichia coli überexprimiert wobei die Immobilisate direkt aus dem Zelllysat durch Zentrifugation auf ähnliche Weise wie CatIBs gewonnen werden konnten. Aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften, belegt durch Lokalisierungsexperimente mit Neodym-Permanentmagneten, konnten die MPAs mit Hilfe magnetischer Säulenmaterialien gereinigt werden. Darüber hinaus konnten katalytisch aktive, magnetische Proteinaggregate (Englisch: catalytically-active magnetic protein aggregates; CatMPAs) des Enzyms RADH durch Anwendung einer biologischen Bait-Prey-Strategie erzeugt werden, wobei RADH posttranslational kovalent an MPAs gebunden wurde. Schließlich erforderte das schnellwachsende Feld der in vivo Enzymimmobilisierung einen Überblick über den aktuellen Stand der Technik. Daher wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit mehrere Übersichtsartikel sowie ein Buchkapitel verfasst. Diese Arbeiten umfassten einen Überblick über verschiedene in vivo Immobilisierungsmethoden, die Anwendungen von immobilisierten Enzymen in der Flusschemie, sowie einen Überblick über Strategien, Vorteile, Nachteile, Anwendungen sowie eine vollständige Methodensammlung zur Produktion und Charakterisierung von CatIBs. Abschließend lässt sich sagen, dass die Verwendung grüner Biokatalysatoren, die mit optimierten in vivo Immobilisierungsstrategien gewonnen wurden, für die breite Akzeptanz der Biokatalyse in der synthetischen Chemie und der Industrie entscheidend ist. Hierbei bietet die Entwicklung neuer und die Verbesserung bestehender Immobilisierungsmethoden, wie sie hier im Rahmen dieser Doktorarbeit durchgeführt wurden, viele Vorteile für die nächste Generation der Industrie, die Wirtschaft und die Umwelt gleichermaßen.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	19.04.2023
Dateien geändert am:	19.04.2023
Promotionsantrag am:	03.11.2022
Datum der Promotion:	25.01.2023