Dokument: Charakterisierung von Methyltransferasen zur enantioselektiven Synthese von Hexahydropyrrolo[2,3-b]indol basierten Naturstoffen
| Titel: | Charakterisierung von Methyltransferasen zur enantioselektiven Synthese von Hexahydropyrrolo[2,3-b]indol basierten Naturstoffen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62423 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230428-112727-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Schneider, Pascal [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke Holger [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Biokatalyse, Methyltransferase | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Im Fokus dieser Arbeit steht die Etablierung von C- und N-Methyltransferasen zur
biokatalytischen und stereoselektiven Bereitstellung bioaktiver Hexahydropyrrolo[2,3-b]indol- Alkaloide, die sich von dem Naturstoff Physostigmin ableiten. Zentrale Aspekte der Untersuchung sind dabei die Charakterisierung von geeigneten Enzymen, ihre präparative Nutzung unter Verwendung eines Cosubstrat-Regenerationssystems und die Untersuchung der Bioaktivität der hergestellten Hexahydropyrrolo[2,3-b]indole. Das Schlüsselenzym PsmD in der Biosynthese von Physostigmin in Streptomyces griseofuscus katalysiert eine stereoselektive C-3 Indol-Methylierung. Dabei bildet sich durch eine sich anschließende intramolekulare Cyclisierung das charakteristische Hexahydropyrrolo[2,3-b]indol-Grundgerüst aus. Obwohl dieser Schritt innerhalb der Biosynthese bereits aufgezeigt werden konnte, gab es bisher keine weiteren Versuche, diese Enzyme umfangreicher zu charakterisieren und für den Einsatz in der Biokatalyse zu nutzen. Im Zuge dieser Arbeit wurde SgPsmD isoliert, gereinigt und biochemisch charakterisiert. Durch Implementierung eines enzymgekoppelten SAM-Regenerationssystems (S-Adenosylmethionin) gelang es unterschiedlich substituierte Hexahydropyrrolo[2,3-b]indole im präparativen Maßstab biokatalytisch herzustellen. Dieser Prozess wurde in der Folge durch den Einsatz und die Charakterisierung eines PsmD Homolog aus Streptomyces albulus optimiert. Um die Pyrroloindolin-Alkaloid-Bibliothek weiter zu diversifizieren, wurde die N-Methyltransferase (N-MT) PsmC, welche ebenfalls an der Physostigmin-Biosynthese beteiligt ist, biochemisch charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass durch den Einsatz dieser N-Methyltransferase eine kinetische Racematspaltung von synthetisch zugänglichen, racemischen Hexahydropyrrolo[2,3-b]indolen mit hoher Selektivität möglich ist. Darüber hinaus konnte das Potential zur gezielten, späten Modifizierung (engl. late-stage modification) von pharmazeutisch relevanten N-Heterozyklen aufgezeigt werden. Die bis dato chemisch nicht zugänglichen, biokatalytisch hergestellten Physostigmin-Derivate wurden hinsichtlich ihrer Bioaktivität gegenüber den medizinisch relevanten molekularen Zielstrukturen AChE (Acetylcholinesterase) und BChE (Butyrylcholinesterase) untersucht. Dabei wurde eine Inhibition dieser Enzyme im nanomolaren Bereich nachgewiesen und eine für bisher charakterisierte Physostigmin-Derivate unübliche Selektivität gegenüber einer der beiden Zielstrukturen wurde beobachtet. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden die bioaktiven Naturstoffe in Zusammenarbeit mit Dr. Benoit David (IBG-4, Forschungszentrum Jülich) hinsichtlich ihres weiteren therapeutischen Potentials evaluiert. Anhand von in silico Untersuchungen konnten neue, potenzielle molekulare Zielstrukturen identifiziert werden. Durch abschließende in silico Bestimmung der pharmakokinetischen Eigenschaften der hergestellten Physostigmin-Derivate konnte die Wirkstofftauglichkeit dieser Naturstoffe untersucht werden. Eine weitere Diversifizierung des Pyrroloindolin-Grundgerüsts scheint dabei notwendig zu sein, um aus den Naturstoffen Wirkstoffe zu generieren. Der Einsatz von Methyltransferasen und deren Optimierung scheint ein geeigneter Schritt auf diesem Weg zu sein.The focus of this work is to establish C- and N-methyltransferases for the biocatalytic and stereoselective production of bioactive hexahydropyrrolo[2,3-b]indol alkaloids derived from the natural product physostigmine. Central aspects of the study are the characterization of suitable enzymes, their preparative use applying a cofactor regeneration system, and investigation of the bioactivity of the hexahydropyrrolo[2,3-b]indoles produced. The key enzyme PsmD in the biosynthesis of physostigmine in Streptomyces griseofuscus catalyses a stereoselective C-3 indole methylation, thereby forming the characteristic pyrroloindoline backbone through a consecutive intramolecular cyclization. Although this step had already been elucidated within the biosynthesis, there have been no further attempts to characterize this enzyme and investigate its use in biocatalysis. In the course of this work, SgPsmD was isolated, purified and biochemically characterized. By implementing an enzymecoupled SAM regeneration system, it was possible to biocatalytically produce various substituted hexahydropyrrolo[2,3-b]indoles on a preparative scale. This process was subsequently optimised by the use and characterisation of a PsmD homolog from Streptomyces albulus. To further diversify the pyrroloindoline alkaloid library, the N-methyltransferase PsmC, also known to be involved in the physostigmine biosynthesis, was biochemically characterised. It was shown that the use of this N-MT enables kinetic resolution of synthetically accessible racemic hexahydropyrrolo[2,3-b]indoles with high selectivity. Furthermore, the enzyme’s potential use for targeted, late-stage modification of pharmaceutically relevant N-heterocycles was demonstrated. The biocatalytically prepared physostigmine-derivatives, which were not chemically accessible before, were investigated regarding their bioactivity towards the medicinally relevant drug targets AChE and BChE. Inhibition of these enzymes in the nanomolar range was demonstrated, and a selectivity to one of the two target structures, which is unusual for physostigmine-derivatives, was observed. Based on these results, the bioactive natural products were evaluated in collaboration with Dr. Benoit David (IBG-4, Forschungszentrum Juelich) with respect to their further therapeutic potential, and new potential targets were identified by in silico investigations. Initial in silico evaluation of the pharmacokinetic properties of the prepared physostigminederivatives revealed the drugability of these natural products. However, further optimisation and in vitro validation is necessary to generate drugs from the obtained natural products. The use and optimisation of methyltransferases seems to be a suitable step on this path. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.04.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.04.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 20.07.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 30.11.2022 |
