Dokument: Pharmakologische Charakterisierung der Phenanthroindolizidin Alkaloide und pilzlichen Metabolite als neue Wirkstoffkandidaten für die Behandlung des Triple-Negativen Brustkrebs
| Titel: | Pharmakologische Charakterisierung der Phenanthroindolizidin Alkaloide und pilzlichen Metabolite als neue Wirkstoffkandidaten für die Behandlung des Triple-Negativen Brustkrebs | |||||||
| Weiterer Titel: | Pharmacological Characterization of Phenanthroindolizidine Alkaloids and Fungal-Derived Metabolites as Novel Drug Candidates for the Treatment of Triple-Negative Breast Cancer | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62334 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230418-114640-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Reimche, Irene [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Teusch, Nicole [Gutachter] Prof. Dr. Kassack, Matthias [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | triple-negative breast cancer (TNBC); phenanthroindolizidine alkaloids; O-methyltylophorinidine; nuclear factor kappa B (NFκB); hypoxia-inducible factor (HIF); tumor microenvironment (TME); 3D spheroid; cancer-associated fibroblast (CAF); growth; invasion; decahydrofluorenes; azaphilones; polyketides; migration | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Triple-negative breast cancer (TNBC), representing the most aggressive form of breast cancer (BC) with currently no targeted therapy available, is characterized by an inflammatory and hypoxic tumour microenvironment (TME). Natural sources provide a broad spectrum of metabolites that are currently utilized as standard chemotherapeutics in TNBC therapy, including paclitaxel, or being investigated as novel drug candidates due to their anti-tumour effects in preclinical studies. Structure–activity relationship (SAR) is important to identify crucial chemical groups that determine compound activity. Furthermore, drug design enables improved activities of naturally occurring metabolites, or generation of novel compounds with selective molecular targets. To identify novel potential agents to combat TNBC, natural products isolated from plants and fungi, as well as synthetically engineered inhibitors of histone deacetylases (HDACIs) were investigated to characterize their pharmacological mechanism of action.
To date, a broad spectrum of anti-tumour activities has been reported for phenanthroindolizidine alkaloids (P-alkaloids), however, their mode of action in TNBC remains elusive. Thus, six naturally occurring P-alkaloids isolated from the plant Tylophora ovata were investigated: O-Methyltylophorinidine (TYLO-1) and its five derivatives tylophorinidine (TYLO-2), tylophoridicine E (TYLO-3), 2-demethoxytylophorine (TYLO-4), tylophoridicine D (TYLO-5), and anhydrodehydrotylophorinidine (TYLO-6). In comparison to the natural TYLO-1 and for more in-depth studies, we also utilized a sample of a chemically prepared O-methyltylophorinidine molecule (TYLO-1s). Our results indicate a remarkably effective blockade of nuclear factor kappa B (NFκB) within 2 h for TYLO-1 and TYLO-1s (IC50 = 17.1 ± 2.0 nM and 3.3 ± 0.2 nM) that is different from its effect on cell viability within 24 h (IC50 = 13.6 ± 0.4 nM and 4.2 ± 1 nM). Furthermore, NFκB inhibition data for the additional five derivatives suggest a SAR. Mechanistically, NFκB is significantly blocked through the stabilization of its inhibitor protein kappa B alpha (IκBα) under normoxic as well as hypoxic conditions. In addition to the transcriptional factors (NFκB and HIF), the transcriptional coactivator yes-associated protein (YAP) was identified as a novel target of TYLO-1 by blocking its nuclear translocation. Knockdown studies targeting NFκB/p65 or YAP expression further support the hypothesis, that the underlying mechanism of P-alkaloids relies on multiple target sites. The TME plays a substantial role in tumour progression and drug resistance, mainly relying on the bidirectional crosstalk of tumour and stromal cells mediated via their secretome, including interleukin (IL)-6 and IL-8. In a direct 2D co-culture of the human TNBC cell line MDA-MB-231 (MB-231) and primary human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), TYLO-1 sufficiently blocked the crosstalk based on the cytokines, presumably by inhibiting NFκB-regulated expression. To better mimic the TNBC TME in vitro, a 3D co-culture was established by combining the human MB-231 with primary murine cancer-associated fibroblasts (CAFs) and type I collagen. TYLO-1 demonstrates superiority against the therapeutic gold standard paclitaxel by diminishing spheroid growth by 40% at 100 nM. The anti-proliferative effect of TYLO-1s is distinct from paclitaxel in that it arrests the cell cycle at the G0/G1 state, thereby mediating a time-dependent delay in cell cycle progression. Furthermore, TYLO-1s inhibited invasion of TNBC monoculture spheroids into a matrigel®-based environment at 10 nM. In conclusion, P-alkaloids serve as promising agents with presumably multiple target sites to combat inflammatory and hypoxia-driven cancer, such as TNBC, with a different mode of action than the currently applied chemotherapeutic drugs. Moreover, P-alkaloids are capable modulators to suppress tumour-promoting features of the TME. Despite various anti-tumour activities, fungus-derived metabolites are not yet approved for cancer therapy. Notably, culture conditions influence the gene expression profile, and thereby, accumulation of fungal metabolites. Hence, compounds were isolated after alteration of cultivation conditions. Regarding metabolites derived from Aspergillus falconensis, NFκB-mediated gene transcription was suppressed in TNBC within 24 h by all nine azaphilones, namely falconensin A, H, I, M, N, O, Q, R, S, that hint to a SAR. Falconensin Q displayed the strongest anti-inflammatory agent (IC50 = 11.9 ± 2.1 μM) with no cytotoxicity detected. Amongst polyketides, isolated from Aspergillus falconensis, sulochrin demonstrated significant suppression of TNBC migration at 70 μM, while monochlorsulochrin showed no effects. Both substances were non-toxic against TNBC. The decahydrofluorenes isolated from Didymella sp. IEA-3B.1, suppressed NFκB-mediated gene transcription within 2 h in TNBC. Didymellanosine (IC50 = 15.5 ± 1.1 μM) was the most potent agent compared to phomapyrrolidone A and ascomylactam C. However, reduced cell viability by ascomylactam C displayed a strong dependency on its anti-inflammatory effects, while phomapyrrolidone A and didymellanosine showed no cytotoxicity. In summary, fungal metabolites possess anti-cancer potential in TNBC at two-digit micromolar concentrations, with hint to a SAR. However, their efficacy is low compared to currently applied chemotherapeutic regimens. Approved targeted therapy options are limited to TNBC patients experiencing metastasis and tumour relapse, which is the main cause of cancer death. Currently novel targeted strategies are explored, including the epigenetic modification by histone deacetylases. In this study, eight chemically prepared HDACIs were examined: LAK41, LAK107, LAK110, LAK121, LAK-ZnFD, KSK64, KSK75 and MPK265, that hint to a SAR. Cell viability was reduced by compounds, that simultaneously target HDAC1 and HDAC6, which are LAK41, KSK64 and MPK265 with an IC50 value of 4.5 ± 1.7 μM, 10.2 ± 4.9 μM and 38.7 ± 1.8 μM, respectively.Der Triple-negative Brustkrebs (TNBC), welcher die aggressivste Form von Brustkrebs (BC) darstellt und derzeit keine gezielte Therapiemöglichkeit hat, ist durch ein inflammatorisches und hypoxisches Tumor Mikromilieu (TME) charakterisiert. Natürliche Ressourcen bieten ein breites Spektrum an Metaboliten, die derzeit als Standard Chemotherapeutika in der TNBC Therapie angewandt werden, miteingeschlossen Paclitaxel, oder welche aufgrund ihrer Anti-Tumor Effekte als neue Arzneimittelkandidaten in präklinischen Studien untersucht werden. Struktur-Aktivitäts Beziehungen (SAR) sind wichtig, um chemische Gruppen zu identifizieren, die entscheidend für die Substanzaktivität sind. Des Weiteren, ermöglicht ein Wirkstoffdesign verbesserte Aktivitäten von natürlich vorkommenden Metaboliten, oder ermöglicht die Herstellung von neuen Wirkstoffen für selektive molekulare Zielstrukturen. Um potenzielle Substanzen zu identifizieren, die den TNBC bekämpfen, wurden Naturprodukte, welche von Pflanzen und Pilzen isoliert wurden, so wie synthetisch entwickelte Histondeacetylase Inhibitoren (HDACIs) hinsichtlich ihrer pharmakologischen Wirkmechanismen untersucht. Bis heute wurden vielfältige Anti-Tumor Wirkungen für die Phenanthroindolizidine Alkaloide (P-alkaloids) berichtet, wobei ihr Wirkmechanismus nach wie vor nicht in TNBC aufgeklärt ist. Deshalb wurden sechs natürlich vorkommende P-alkaloids, die von der Pflanze Tylophora ovata isoliert wurden, untersucht: O-Methyltylophorinidine (TYLO-1) und dessen fünf Derivate Tylophorinidine (TYLO-2), Tylophoridicine E (TYLO-3), 2-Demethoxytylophorine (TYLO-4), Tylophoridicine D (TYLO-5) und Anhydrodehydrotylophorinidine (TYLO-6). Im Vergleich zum natürlich vorkommenden TYLO-1 und für ausführlichere Studien wurde das chemisch hergestellte O-Methyltylophorinidine (TYLO-1s) verwendet. Unsere Ergebnisse weisen auf eine bemerkenswerte effektive Blockade vom Nuclear Factor Kappa B (NFκB) innerhalb von 2 h hin, wobei sich die Wirkung von TYLO-1 und TYLO-1s (IC50 = 17.1 ± 2.0 nM und 3.3 ± 0.2 nM) von der reduzierten Zellviabilität innerhalb von 24 h unterscheidet (IC50 = 13.6 ± 0.4 nM und 4.2 ± 1 nM). Außerdem suggerieren die Daten der NFκB-inhibition eine SAR. Mechanistisch basiert die signifikante NFκB Blockade auf die Stabilisierung vom Inhibitor Protein Kappa B Alpha (IκBα) unter Normoxie so wie auch unter hypoxischen Bedingungen. Zusätzlich zur Inhibition von Transkriptionsfaktoren (NFκB und HIF), wurde der Transkriptions-Koaktivator Yes-assoziiertes Protein (YAP) als neues Zielprotein von TYLO-1 entdeckt, welches die YAP Translokation in den Nucleus unterbindet. Die Protein Knockdown Studien mit NFκB/p65 oder YAP unterstützen die Hypothese, dass die Anti-Tumor Wirkung von P-alkaloids auf multiple molekulare Inhibitionen beruhen. Das TME spielt eine wesentliche Rolle bei der Tumorprogression und Wirkstoffresistenz. Dabei basiert die bidirektionale Interaktion von Tumor und Stroma Zellen auf deren Sekretom, miteingeschlossen Interleukin (IL)-6 und IL-8. In einer direkten 2D Ko-Kultur von der humanen TNBC Zelllinie MDA-MB-231 (MB-231) und primären, periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) unterdrückte TYLO-1 die Interaktion, welche auf den Zytokinen beruht, wahrscheinlich durch die Blockade der NFκB-regulierten Expression. Für eine bessere in vitro Nachahmung des TNBC TME, wurde eine 3D Ko-Kultur aus humanen MB-231, so wie primären, murinen Krebs-assoziierten Fibroblasten (CAFs) und Typ I Kollagen hergestellt. TYLO-1 demonstriert eine Überlegenheit gegenüber dem therapeutischen Goldstandard Paclitaxel durch eine Verringerung des Sphäroidwachstums um 40% bei 100 nM. Die anti-proliferativen Effekte von TYLO-1s unterscheiden sich zu Paclitaxel, indem die den Zellzyklus in der G0/G1 Phase anhalten, wodurch eine zeitabhängige Verzögerung der Zellzyklus Progression vermittelt wird. Darüber hinaus, inhibiert TYLO-1s mit 10 nM die Invasion von TNBC Monokultur Sphäroiden in ein Matrigel®-basiertes Milieu. Zusammengefasst sind P-alkaloids vielversprechende Wirkstoffe mit wahrscheinlich multiplen Zielstrukturen, um Inflammation- und Hypoxie-angetriebene Krebsarten, inklusive TNBC, zu besiegen. Dabei haben die P-alkaloids eine andere Wirkweise als die derzeit angewandten Chemotherapeutika. Ebenfalls sind die P-alkaloids wirksame Modulatoren, um das Tumor-fördernde TME zu unterdrücken. Trotz einer Breite von Anti-Tumor Effekten, sind Pilzmetabolite bisher nicht für eine Krebstherapie zugelassen. Grundsätzlich beeinflusst die Kultivierung das Genexpressions Profil und damit die Akkumulation von Pilzmetaboliten. Daher, wurden Pilzsubstanzen nach Veränderung der Kulturbedingungen isoliert. Mit Hinblick auf Metabolite, die aus dem Aspergillus falconensis isoliert wurden, wurde die NFκB-vermittelte Genexpression in TNBC innerhalb von 24 h von allen neun Azaphilonen blockiert, was eine SAR suggeriert. Namentlich gehören dazu Falconensin A, H, I, M, N, O, Q, R und S. Falconensin Q ist die effektivste anti-inflammatorische Substanz (IC50 = 11.9 ± 2.1 μM), die keine Zytotoxizität aufweist. Unter den Polyketiden, welche vom Aspergillus falconensis isoliert wurden, zeigte Sulochrin eine signifikante Unterdrückung der TNBC Migration mit 70 μM, wobei Monochlorsulochrin keine Effekte hatte. Beide Substanzen waren nicht toxisch gegen TNBC. Die Decahydrofluorene, die von Didymella sp. IEA-3B.1 isoliert wurden, inhibierten die NFκB-vermittelte Genexpression in TNBC innerhalb von 2 h. Didymellanosine (IC50 = 15.5 ± 1.1 μM) war die stärkste Substanz im Vergleich zu Phomapyrrolidone A und Ascomylactam C. Allerdings, zeigte die reduzierte Zellviabilität durch Ascomylactam C eine stärkere Abhängigkeit von der anti-inflammatorischen Wirkung, während Phomapyrrolidone A und Didymellanosine nicht zytotoxisch wirkten. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Pilzmetabolite bei TNBC in zweistelligen mikromolaren Konzentrationen krebshemmend wirken, wobei eine SAR vorliegt. Allerdings ist die Substanzwirkung sehr gering im Vergleich zu derzeit angewandten Chemotherapeutika. Die Möglichkeiten zur gezielten Therapie sind nur für TNBC Patienten genehmigt, die bereits Metastasierung oder ein Tumor Rezidiv erfahren haben, was zur Haupt-Todesursache zählt. Derzeit werden neue zielgerichtete Therapie Strategien erforscht, einschließlich die epigenetische Modifikation durch Histondeacetylasen. In dieser Studie wurden acht chemisch produzierte HDACIs untersucht: LAK41, LAK107, LAK110, LAK121, LAK-ZnFD, KSK64, KSK75 und MPK265, die auf eine SAR hindeuten. Die Zellviabilität wurde von Molekülen reduziert, welche simultan das HDAC1 und HDAC6 blockieren. Dazu zählen LAK41, KSK64 und MPK265 mit jeweils einem IC50 Wert von 4.5 ± 1.7 μM, 10.2 ± 4.9 μM and 38.7 ± 1.8 μM. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Bezug: | 2018-2023 | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.04.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.04.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 15.02.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 24.03.2023 |
