Dokument: Herstellung eines IL-6R und TNF spezifischen Inhibitors der ADAM17 Protease

Titel:	Herstellung eines IL-6R und TNF spezifischen Inhibitors der ADAM17 Protease
Weiterer Titel:	Designing an IL-6R and TNF specific ADAM17 inhibitor
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62324
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230405-093504-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Krusche, Matthias [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,88 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 29.03.2023 / geändert 29.03.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Jürgen Scheller [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Däubener, Walter [Gutachter]
Stichwörter:	IL-6R, TNF, ADAM17, Drugdesign, IL-6, Zytokin, Inflammation, classic signaling, trans signaling,
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die A Disintegrin And Metalloproteasen (ADAM) ADAM10 und ADAM17 sind an vielen biologischen Prozessen wie Entwicklung, Geweberegeneration und der Immunan-twort beteiligt. ADAM17 wurde im Zusammenhang mit der proteolytischen Abspaltung von Tumornekrosefaktor (TNF) von der Zellmembran entdeckt. Zusätzlich ist ADAM17 verantwortlich für das ectodomain shedding des Interleukin 6 Rezeptors (IL-6R), was zur Bildung von löslichem IL-6R führt und IL-6 trans-signaling ermöglicht. IL-6 classic signaling über membranständigen IL-6R dient hauptsächlich regenerativen Zwecken, während IL-6 trans-signaling über löslichen IL-6R hauptsächlich mit einem chronisch inflammatorischen Phänotyp korreliert. Eine Dysregulation von ADAM17 findet sich in einer Vielzahl von inflammatorischen Störungen, wie rheumatoider Arthritis, chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen und malignen Tumoren. Eine Globale Inhibition der Aktivität dieser Enzyme mit Antikörpern oder niedermolekularen Substanzen führte jedoch zu erheblichen Nebenwirkungen, wahrscheinlich aufgrund der großen Anzahl von Substraten dieser Proteasen. Ziel dieser Arbeit war es, zu untersuchen, ob es durch den Einsatz von substratspezifi-schen ADAM17 Inhibitoren, möglich ist die Freisetzung von Zytokinen und Rezeptoren durch ADAM vermitteltes ectodomain shedding spezifisch für ausgewählte Substrate zu blockieren. Es wurden Fusionsproteine erstellt, die spezifische Bindestrukturen wie Pep-tide oder Einzeldomänenantikörper mit natürlichen Proteaseinhibitoren aus der Familie der Tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMP) verbinden. Aus Gründen der Aufrei-nigung, Avidität und Löslichkeit befindet sich am C-Terminus der Fusionsproteine der Fc-Teil eines IgG Antikörpers. Es wurden mehrere Fusionsproteine designed, hergestellt und charakterisiert, die TIMP1 oder TIMP3 in Kombination mit verschiedenen Einzeldomänenantikörpern oder Binde-peptiden enthielten. Zur Herstellung dieser Fusionsproteine wurden stabile Zelllinien erstellt und die Proteine aus dem Überstand dieser gereinigt und charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass mit Fusionsproteinen aus TIMP1 und TIMP3 Varianten in Kombination mit einem IL-6R spezifischen Einzeldomänenantikörper selektiv das ecto-domain shedding des IL-6R blockiert werden konnte, während andere ADAM17 Sub-strate wie z.B. TNF nicht beeinflusst wurden. Zusätzlich konnte durch die Verwendung eines anti-TNF Einzeldomänenantikörpers ein TNF selektiver ADAM17 Inhibitor herge-stellt werden, der spezifisch das Shedding von TNF blockierte. The A Disintegrin And Metalloproteinases (ADAM) including ADAM10 and AD-AM17 are involved in a plethora of biological functions including development, tissue regeneration and immune responses. ADAM17 was initially identified as a tumor necro-sis factor (TNF) cleaving enzyme. In addition, ADAM17 is also responsible for ectodo-main shedding of the interleukin 6 receptor (IL-6R), a process that generates soluble IL-6R and is a key requirement for IL-6 trans-signaling. IL-6 signaling via the membrane bound IL-6R is involved in mainly regenerative processes while IL-6 trans-signaling via a soluble form of the IL-6R is attributed with a chronic inflammatory phenotype. Con-sequently, it is not surprising that dysregulation of ADAM17 is found in many inflam-matory disorders including rheumatoid arthritis, inflammatory bowel disease and cancer. Hence, it is not suprising that ADAM10 and ADAM17 are considered as promising promising drug targets. However, global targeting of both enzymes with antibodies or small molecule drugs resulted in extensive side effects most likely due to the multitude of substrates of the proteases. Our aim was to develop a strategy to selectively prevent the release of active cytokines or receptors by ADAM mediated ectodomain shedding. Therefore, we employed fusion proteins combining substrate specific binding structures like peptides or single domain antibodies with naturally occurring tissue inhibitors of metalloproteinases. For purifica-tion, avidity and solubility purposes the Fc part of an IgG antibody was included at the C-terminus of the fusion proteins. We designed, generated and characterized different fusion proteins containing TIMP1 and TIMP3 combined with various single domain antibodies or binding peptides. Stably transfected cell lines were generated, the proteins were purified from the cell´s superna-tant and characterized. These fusion proteins composed of TIMP1 or TIMP3 with an IL-6R specific single domain antibody selectively inhibit ectodomain shedding of IL-6R, while not affecting the shedding of other substrates like TNF. Furthermore, we estab-lished a fusion protein containing an anti-TNF single domain antibody, which selectively targeted tumor necrosis factor ectodomain shedding.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II
Dokument erstellt am:	05.04.2023
Dateien geändert am:	05.04.2023
Promotionsantrag am:	05.08.2021
Datum der Promotion:	28.03.2023