Dokument: Etablierung eines Hypoxie-/Reoxygenierungsmodells zur Untersuchung des Einflusses von Erythropoietin (EPO) und carbamyliertem Erythropoietin-Fc (cEPO-Fc) auf die intrazellulären Vorgänge in neuronalen Zellkulturen

Titel:	Etablierung eines Hypoxie-/Reoxygenierungsmodells zur Untersuchung des Einflusses von Erythropoietin (EPO) und carbamyliertem Erythropoietin-Fc (cEPO-Fc) auf die intrazellulären Vorgänge in neuronalen Zellkulturen
Weiterer Titel:	Establishment of a hypoxia-/reoxygenation model for analyzing the influence of Erythropoietin (EPO) and carbamylated Erythropoietin-Fc (cEPO-Fc) on intracellular processes in neuronal cell culture
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62314
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230411-114102-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Timbul, Laura [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,41 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 28.03.2023 / geändert 28.03.2023
Beitragende:	PD Dr. med. Simon, Florian [Gutachter] Prof. Dr. Bauer, Inge [Gutachter] PD Dr. Med. Gombert, Alexander [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Thorakale Aortenpathologien wie Aortenaneurysmata und -dissektionen treten in der Bevölkerung mit einer Inzidenz von 5,9 bzw. 6 pro 100.000 Patientenjahre auf und sind häufig asymptomatische Erkrankungen, die jedoch unbehandelt zur Ruptur und damit zum Versterben des Betroffenen führen können. Daher wurde in den letzten Jahren das Screening hierauf erweitert, um eine rechtzeitige Therapie zu ermöglichen. Eine gefürchtete Komplikation bei invasiven Therapien von thorakalen Aortenpathologien ist eine Paraplegie oder Paraparese. In mehreren Tier- und Zellkulturexperimenten hatten sich Erythropoietin (EPO) und sein modifiziertes carbamyliertes Derivat cEPO-Fc als zytoprotektive Substanzen herauskristallisiert. Ziel der Arbeit war die Entwicklung eines zuverlässigen, reproduzierbaren Modells für neuronale Zelllinien, in dem die klinische Sequenz von Ischämie und Reperfusion in Form von Hypoxie und Reoxygenierung nachgestellt werden kann. Zudem wurde der Einfluss von EPO und cEPO-Fc auf das hier etablierte Modell untersucht. Zur Vorbereitung des Zellkulturmediums, der Hypoxieinduktion und -aufrechterhaltung wurde eine Hypoxiebank genutzt. Hier wurde eine konstante, leicht reproduzierbare Hypoxie in der Atmosphäre und im Zellkulturmedium erreicht. Die Hypoxietoleranz der neuronalen humanen Zelllinien IMR-32, SH-SY5Y und der murinen Zelllinie Neuro-2A wurde mittels morphologischer Aspekte, Viabilitätsassay und Western Blot bestimmt und über einen Zeitraum von 48, respektive 72 und 24 Stunden analysiert. Diese Aspekte, insbesondere die Analyse von apoptoserelevanten Proteinen im Western Blot, wurden auch unter Zugabe von 0,2 und 20 IU/ml EPO oder 0,2 und 20 µg/ml cEPO-Fc evaluiert. Es stellte sich heraus, dass die Viabilität während Hypoxie und Reoxygenierung in IMR-32 und Neuro-2A signifikant abfiel. In den SH-SY5Y war keine signifikante Veränderung der Viabilität messbar. EPO zeigte keinen Einfluss, cEPO-Fc bewirkte dosisunabhängig eine signifikant verminderte Viabilität in den Neuro-2A unter Hypoxie und Reoxygenierung. Der vorherig in vivo und in vitro gezeigte zytoprotektive Effekt der beiden Substanzen konnte auch im Western Blot nicht reproduziert werden. Ursächlich für die sich teilweise widersprechenden bzw. unerwarteten Ergebnisse der pro- und antiapoptotischen Proteine im Gegensatz zum physiologischen Modell könnte das veränderte Proliferationsverhalten der hier genutzten Zelllinien sein, die aus Tumorgewebe stammen. Zudem wurde nicht zwischen Apoptose und Nekrose unterschieden. Ein Großteil der Zellen könnte bereits in einer Nekrose untergegangen sein, was zu unkontrollierter Freisetzung von Proteinen und somit deren Nachweis führen würde. Diese Arbeit dient als Grundlage für weitere Untersuchungen mit den neuronalen Zellkulturen. Das Hypoxiemodell und -protokoll sollte nach weiterführender Analyse, beispielsweise mittels FACS (fluorescence-activated cell sorting) zur Differenzierung von Apoptose und Nekrose, weiterentwickelt und gegebenenfalls die Sauerstoffkonzentration in der Hypoxiebank an die daraus resultierenden Ergebnisse angepasst werden. Thoracic pathologies of the aorta, such as aneurysm or dissection have an incidence of 5.9 and 6 per 100,000 patient years. Often, they are asymptomatic; however there is a risk of rupture and consequently death. That is why screening methods had been promoted within the last years to enable an early therapy. Paraplegia and paraparesis are highly feared complications during invasive therapies on aortic pathologies. Multiple animal- and cell culture experiments have proven erythropoietin (EPO) and its modified derivate carbamylated erythropoietin-Fc (cEPO-Fc) to be cytoprotective substances. A reliable, easily replicable model for neuronal cell lines should now be developed, in which the clinical sequence of ischemia and reperfusion in the form of hypoxia and reoxygenation can be modeled. Subsequently, the influence of EPO and cEPO-Fc was analysed. A hypoxic workstation was used for the preparation of the cell culture medium, as well as the induction and maintenance of hypoxic conditions. That way a constant, easily replicable hypoxia was achieved in atmosphere and medium. The hypoxic tolerance of the neuronal human tumor cell lines IMR-32, SH-SY5Y, and murine Neuro-2A was determined by morphology, viability assay and Western Blot, and was set to 48, 72, and 24 hours respectively, followed by 24 hours of reoxygenation. These aspects, especially the Western Blot analysis of relevant proteins in apoptosis, were also evaluated after adding 0.2 and 20 IU/ml EPO or 0.2 and 20 µl/ml cEPO-Fc. A significant reduction in viability in IMR-32 and Neuro-2A during hypoxia and reoxygenation was shown. In SH-SY5Y no significant difference was measurable. EPO did not show any influence in any cell line, cEPO-Fc led to a dose-independent reduction in viability in Neuro-2A during hypoxia and reoxygenation. The cytoprotective effect previously shown in vivo and in vitro of both substances could not be reproduced. An explanation for the partially contradicting or unexpected results of the pro- and anti-apoptotic proteins could be altered proliferation behavior of cell lines that originate from tumor tissue. Additionally, there was no differentiation between apoptosis and necrosis. A large part of the cells could already have undergone necrosis, which would lead to an uncontrolled release of proteins and consequently the proteins' detection. This work serves as the basis for further investigation with neuronal cell cultures. After further analysis, for example using FACS (fluorescence-activated cell sorting) to differentiate apoptosis and necrosis, the hypoxia model and protocol should be reevaluated and, if necessary, the oxygen concentration in the hypoxia bank adjusted.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	11.04.2023
Dateien geändert am:	11.04.2023
Promotionsantrag am:	07.10.2022
Datum der Promotion:	09.03.2023