Dokument: Systematische Untersuchung des Einflusses von PGRMC1 und PHB2 auf die Aktivierung und Lokalisation von ERa nach Stimulation mit dem Progestin NET in Brustkrebszelllinien

Titel:	Systematische Untersuchung des Einflusses von PGRMC1 und PHB2 auf die Aktivierung und Lokalisation von ERa nach Stimulation mit dem Progestin NET in Brustkrebszelllinien
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62123
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230307-105926-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hasenkox, Josephine Aimee [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,59 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.03.2023 / geändert 01.03.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Neubauer, Hans [Gutachter] Prof. Dr. med. Pongratz, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Das Auftreten von Brustkrebs ist während der Einnahme einer Hormonersatztherapie signifikant erhöht. Dabei treten insbesondere Östrogen-Rezeptor-positive Tumoren auf. Eine Aktivierung des Östrogen-Rezeptors a (ERa) kann durch das multifunktionale Protein Progesterone Receptor Membrane Component 1 (PGRMC1) beeinflusst werden, welches in ERa-positiven Tumoren hochreguliert ist. Neueste Arbeiten konnten zeigen, dass das ERa- regulierende Protein Prohibitin 2 (PHB2) mit PGRMC1 interagiert. PHB2 könnte daher als Mediator zwischen PGRMC1 und ERa eine entscheidende Rolle in der Brustkrebspathologie spielen. Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Interaktion zwischen ERa, PGRMC1 und PHB2 sowie der Mechanismen, die zu einer ERa-Aktivierung und erhöhten Zellproliferation führen. Die Bestimmung der Lokalisation der einzelnen Proteine sollte dabei mittels subzellulärer Fraktionierung durchgeführt werden, welche in dieser Arbeit zunächst in der ERa-positiven Brustkrebszelllinie MCF-7 etabliert wurde. Die Lokalisation von PGRMC1 sowie ERa wurde nachfolgend mittels Immunfluoreszenzfärbung verifiziert. Anschließend wurde die Lokalisation der Proteine in Folge der Stimulation mit dem Progestin Norethisteron (NET), welches das Brustkrebsrisiko erhöht, mittels subzellulärer Fraktionierung untersucht. Zur Analyse der ERa-Aktivierung nach der Stimulation mit NET wurde die Phosphorylierung von ERa an der Aminosäure Serin 118 (S118) mittels einer Zeitkinetik im Western Blot und in der Immunfluoreszenzfärbung untersucht. Zur Untersuchung der Bedeutung von PGRMC1 für die Zellhomöostase wurden zwei PGRMC1- Knockout-Zelllinien verwendet. Die Bestätigung des Knockouts (KO) erfolgte dabei auf Protein-Ebene mittels Western Blot. Um funktionelle Auswirkungen des PGRMC1-Verlustes zu detektieren, wurden ERa-Phosphorylierung und Aktivierung in PGRMC1-KO-Zellen bestimmt. Die Methode der subzellulären Fraktionierung konnte in MCF-7 erfolgreich etabliert werden. Mittels dieser konnte eine quantifizierbare Analyse der Proteinlokalisation durchgeführt werden. Die Lokalisation von ERa, PGRMC1 und PHB2 wurde sowohl vor als auch nach NET-Stimulation festgestellt. In der Zeitkinetik konnte eine dynamische Phosphorylierung von ERa an S118 nach NET-Stimulation festgestellt werden, ebenso eine Translokation von ERa in den Zellkern. Die Proteine PGRMC1 und PHB2 veränderten hingegen ihre Lokalisation nach NET-Stimulation nicht und verblieben extranukleär. Im Western Blot konnte die ERa-Expression und Phosphorylierung auch in PGRMC1-KO- Zelllinien festgestellt werden. Der Verlust von PGRMC1 führte zu keiner signifikanten Veränderung der Proliferation in PGRMC1-KO-Zellen im Vergleich zur parentalen MCF-7-Zelllinie. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf eine funktionelle Interaktion zwischen ERa, PGRMC1 und PHB2 in Brustkrebszelllinien hin, was einen Einfluss auf die ERa-Aktivierung hat. Die Stimulation mit dem Progestin NET scheint darüber hinaus einen PGRMC1- unabhängigen, proliferationsfördernden Einfluss zu entfalten. Dieser besteht auch bei einem Knockout von PGRMC1. Zum Verständnis und der Prävention von Therapieresistenzen sollten die zugrunde liegenden Signalwege weiter untersucht werden. Women receiving hormone replacement therapy (HRT) are at higher risk for developing breast cancer, especially estrogen receptor positive tumors. The multifunctional protein progesterone receptor membrane component 1 (PGRMC1) was shown to be upregulated in estrogen receptor a (ERa) positive tumor tissues and its overexpression in breast cancer cell lines results in increased ERa activation. Recent studies indicate that PGRMC1 interacts with the ERa regulatory protein prohibitin 2 (PHB2) and reduces its interference with the oncogenic signaling of ERa in breast cancer. The aim of this study was to investigate the functional interplay between ERa, PGRMC1 and PHB2 and to further characterize the signaling pathways leading to ERa activation and increased cancer cell proliferation. For subsequent investigation of the localization of the proteins of interest, subcellular fractionation was established in the ERa positive breast cancer cell line MCF-7. The findings were validated via immunofluorescence staining. Subsequently, localization of PGRMC1, ERa and PHB2 was analyzed upon treatment of PGRMC1-overexpressing MCF-7 breast cancer cells with the progestin norethisterone (NET), which is reported to increase the risk for developing breast cancer. To analyze possible ERa activation upon progestin stimulation, the ERa-phosphorylation at serine 118 (S118) was detected via western blot and immunofluorescence staining after treatment with NET for different time periods. Since NET-metabolites may activate ERa in a ligand- dependent manner, two PGRMC1-deficient knockout cell lines were analyzed with respect to ERa phosphorylation and cell proliferation to dissect PGRMC1-specific from PGRMC1- unspecific effects. Subcellular fractionation was successfully established in MCF-7, enabling a quantifiable analysis of protein localization. Consequently, localization of ERa, PGRMC1 and PHB2 could be determined upon stimulation with NET. Time kinetics showed a dynamic phosphorylation of ERa at S118 upon NET stimulation, leading to ERa translocation into the nucleus. For PGRMC1 and PHB2, no translocation could be observed upon progestin treatment. In PGRMC1-deficient cell lines the dynamics of ERa phosphorylation were similar to the parental cell line MCF-7, pointing towards a PGRMC1-independent NET-effect on ERa. Consequently, cell proliferation of PGRMC1-deficient cell lines increased in response to NET treatment to a similar extent as of MCF-7, while proliferation of the PGRMC1-overexpressing cells increased significantly stronger. Findings of this study emphasize the dual effect of NET on ERa activation which is propagated via ERa phosphorylation and via indirect ERa activation through the PGRMC1- PHB-axis. Further investigation of signaling pathways needs to be performed to gain deeper insight into the mechanism underlying the increased breast cancer risk upon HRT.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	07.03.2023
Dateien geändert am:	07.03.2023
Promotionsantrag am:	25.09.2022
Datum der Promotion:	28.02.2023