Dokument: Rekombinante Alkaloidproduktion in Pseudomonas putida mit Hilfe modularer Systeme zur Genclusterexpression

Titel:	Rekombinante Alkaloidproduktion in Pseudomonas putida mit Hilfe modularer Systeme zur Genclusterexpression
Weiterer Titel:	Recombinant alkaloid production in Pseudomonas putida using modular systems for gene cluster expression
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62033
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230227-091737-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Weihmann, Robin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,38 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.02.2023 / geändert 20.02.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Martina Pohl [Gutachter]
Stichwörter:	Synthetische Biologie, Naturstoffbiosynthese, Expressionssysteme, Genclusterexpression
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Mikrobielle Sekundärmetabolite stellen eine reiche Quelle potenziell pharmazeutisch nutzbarer Naturstoffe dar, weshalb sie die wissenschaftliche Aufmerksamkeit schon lange auf sich ziehen. Das bioaktive Tripyrrolalkaloid Prodigiosin ist beispielsweise bereits gut untersucht. Allerdings umfasst die Klasse der Prodiginine noch weitere Substanzen mit ähnlichem Aufbau, die weit weniger untersucht wurden, da kein Zugang durch heterologe Produktion bestand. Entscheidend ist bei der entsprechenden Forschung unter anderem die Effektivität der Expressionssysteme. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das yTREX-System daher genutzt, um heterologe Produktionsstämme bisher nicht produzierbarer Prodiginine sowie Stämme zur Effektivitätssteigerung der Mutasynthese zu erzeugen. Es konnte dabei durch die Expression der Zyklase Prub680 aus P. rubra in einem Prodigiosin produzierenden P. putida-Stamm die in vivo Umwandlung zu Cycloprodigiosin, sowie durch die Integration eines artifiziellen Genclusters aus pig-Genen von S. marcescens zur Biosynthese von Norprodigiosin, ebenfalls in P. putida die erstmalige heterologe Produktion von Norprodigiosin gezeigt werden. Zudem konnten, ebenfalls durch die Integration eines artifiziellen pig-Genclusters, Stämme erzeugt werden, welche aufgrund ihrer deutlich erhöhten Produktionsleistung der Bipyrrolvorstufe MBC die Effektivität der Mutasynthese im Vergleich zum bisher genutzten Stamm erheblich steigern konnten. Zudem konnte das bisher zur heterologen Expression genutzte yTREX-System zu einer breit und flexibel anwendbaren yTREX-Toolbox weiterentwickelt werden, welche die Handhabung und Anwendungs-möglichkeiten des Systems deutlich verbessern bzw. erweitern. Das System ermöglicht dabei eine einfache Klonierung sowie die Integration verschiedener genetischer Elemente nach standardisierten Verfahren. Durch die Auswahl aufeinander abgestimmter Gene, welche als Transkriptionsreporter und Selektionsmarker eingesetzt werden, können diese nach dem Modularitätsprinzip einzeln ausgetauscht werden, um eine maximale Flexibilität sowie die Auswahl zwischen händischem wie auch automatisiertem Screening zu ermöglichen. Außerdem kann durch die Wahl einer von drei Varianten des Grundvektors der gewünschte Integrationsmodus in das bakterielle Genom definiert werden, sodass die Anpassbarkeit des Systems an verschiedene Anforderungen der synthetischen Biologie hoch ist. Abschließend konnte die Funktionalität des Systems am Beispiel des Violacein-Genclusters demonstriert werden. Dabei konnte das Gencluster erfolgreich an zufälligen Orten, wie auch in spezifische 16S-Gene der rrn-Operons von P. putida genomisch integriert werden. Die erste Anwendung zeigte dabei die gute Eignung des Tn5-Konzepts als genomweite Screening-Methode, während die direkte Integration in die rrn-Operons von P. putida zur direkten Erzeugung von Stämmen mit hoher Produktionsleistung um 100 mg/l Deoxyviolacein führte. Microbial secondary metabolites represent a rich source of potentially pharmaceutically useful natural products, which have attracted high scientific attention. The bioactive tripyrrole alkaloid prodigiosin, for example, has been well studied, but the class of prodiginins includes other substances with similar structures that have been studied much less, due to lack of access through heterologous production. Among other things, the effectiveness of the expression systems is crucial. In this work, the yTREX-System was used to generate heterologous production strains of previously inaccessible prodiginins, as well as strains to increase the efficiency of mutasynthesis. The expression of cyclase Prub680 from P. rubra in prodigiosin-producing P. putida strains was shown to lead to in vivo conversion to cycloprodigiosin. Moreover, the integration of an artificial cluster of prodigiosin genes from S. marcescens for the biosynthesis of norprodigiosin, also in P. putida, resulted in the first heterologous production of norprodigiosin. In addition, by integrating an artificial gene cluster, strains with significantly increased production capacity of the bipyrrole precursor MBC were successfully constructed. These strains showed a considerably increased efficiency of mutasynthesis compared to the previously used strain. The yTREX-System previously used for heterologous expression was further developed into a broadly and flexibly applicable yTREX-toolbox, which significantly improves and expands the handling and application of the system. The system allows easy cloning and integration of different genetic elements according to standardized procedures. Specifically selected genes, which are used as transcription reporters and selection markers, can be exchanged individually according to the modularity principle to allow maximum flexibility and the choice between manual and automated screening. In addition, by choosing one of three variants of the basic vector, the desired mode of integration into the bacterial genome can be defined, which facilitates high adaptability of the system to different requirements of synthetic biology. Finally, the functionality of the system was demonstrated using the violacein gene cluster as an example. The gene cluster was successfully genomically integrated into random sides as well as into specific 16S genes of the rrn-operons of P. putida. The first application thereby demonstrated the good suitability of the Tn5 concept as a genome-wide screening method, while the direct integration into the rrn-operons of P. putida led to the generation of strains with high production levels of around 100 mg/l deoxyviolacein.
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Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	27.02.2023
Dateien geändert am:	27.02.2023
Promotionsantrag am:	10.05.2022
Datum der Promotion:	14.09.2022