Dokument: Identification, characterization and optimization of peptide ligands for therapeutic applications

Titel:	Identification, characterization and optimization of peptide ligands for therapeutic applications
Weiterer Titel:	Identifizierung, Charakterisierung und Optimierung von Peptidliganden für therapeutische Anwendungen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=62013
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230223-104706-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Sevenich, Marc Michael [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 88,71 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.02.2023 / geändert 20.02.2023
Beitragende:	Prof.Dr. Willbold Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Hoyer, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Bayer, Peter [Gutachter]
Stichwörter:	alpha synuclein, α-syn, Parkinson's disease, mirror-image phage display, PD, all-D peptides, D-enantiomeric peptide, peptide therapeutics, anti-prionic mode of action, CNS therapeutics, neurodegenerative disease, alpha-synuclein oligomers and fibrils, amyloids, severe respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2, spike protein, receptor binding domain, RBD, human angiotensin converting enzyme 2, hACE2, fusion inhibitors, secondary conformation, fibril and oligomer tracer
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The identification, characterization and optimization of therapeutic agents are key issues for today's pharmaceutical industry. In particular, innovative treatment and development strategies are required that either target diseases which are considered incurable or provide short development times in response to novel emerging diseases. In this work, phage display selection was performed as a starting point for the development of peptide drugs against the two target diseases, Parkinson's disease (PD) as well as coronavirus disease 2019 (COVID-19). PD is the most common neurodegenerative movement disorder worldwide. A central feature is the progressive degeneration of dopaminergic neurons, which is associated with the accumulation of cytosolic inclusions called Lewy bodies. These consist largely of the pre-synaptically located, physiologically intrinsically unfolded and monomeric protein alpha-synuclein (α-syn), which, under disease-promoting conditions, associates with itself and deposits in structured biopolymers, called fibrils. During aggregation of α-syn, soluble oligomers are formed, which are thought to be the key-factor for neurodegeneration. In addition, it is hypothesized that prion-like α-syn structures can spread between cells and induce aggregation in recipient cells, ultimately leading to spread of neuropathology and disease progression. In this work, mirror-image phage display on the D-enantiomeric full-length α-syn was performed for the identification of all-D-enantiomeric peptides that bind to the unstructured monomer with high affinity, thereby stabilizing the physiological status and preventing aggregation. In addition, initial sequence optimizations were investigated with respect to their ability to eliminate α-syn oligomers and thus recover active monomer. Another target disease addressed in this work is caused by the beta-coronavirus severe respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2), first identified in Wuhan (China) in 2019. The high transmission efficiency between humans has resulted in a worldwide pandemic, with the disease primarily affecting the upper respiratory tract as well as the lung epithelium. Severe courses of coronavirus disease 2019 (COVID-19) can result in systemic inflammatory responses eventually leading to multi-organ failure (MOF). The SARS-CoV-2 replication cycle is a multi-step process initiated by cell contact of the viral spike protein and human angiotensin converting enzyme 2 (hACE2). To lay a foundation for the subsequent project, the interaction of the SARS-CoV-2 spike protein with hACE2 was first kinetically characterized in a separate project, where a secondary binding state within the already formed complex could be identified. This increases the affinity of the virus on the cell surface and is a potential factor that can be modulated among the currently circulating variants of concern (VOC). Based on these findings, phage display selection was performed on the receptor binding domain (RBD) of the SARS-CoV-2 spike protein to identify peptide ligands that block association with hACE2 and displace the receptor from the already formed complex. For this purpose, the interaction kinetics of the peptides with the spike protein were investigated and validated with respect to inhibition of hACE2 binding. Rational design using the combination of sequences in divalent approaches led to improved inhibitory effects. To address the previously alluded projects, a novel phage display selection protocol was developed that introduces control selections and a next generation sequencing (NGS)-based sequence analysis to specifically identify sequence variants that exhibit binding to the respective target protein. This protocol was also applied to the target proteins SARS-CoV-2 3C like protease (3CLpro, COVID-19) and hSOD1 (human superoxide dismutase, Amyotrophic lateral sclerosis (ALS)) in separate projects. Here, the screening protocol also led to the identification of peptide ligands that can be considered for therapeutic applications after appropriate optimization. In addition, the use of fibrillar α-syn as a target, demonstrates the development of peptide ligands for diagnostic purposes. In summary, the combined results of the different projects allow the derivation of a general approach for the development of therapeutic and diagnostic peptide ligands. Die Identifizierung, Charakterisierung und Optimierung von therapeutischen Wirkstoffen ist ein Schlüsselthema für die heutige Pharmaindustrie. Insbesondere werden innovative Behandlungs- und Entwicklungsstrategien für jene Erkrankungen benötigt, die entweder als unheilbar gelten, oder kurze Entwicklungszeiten als Reaktion auf neu auftretende Krankheiten bieten. In dieser Arbeit wurde eine Phagen-Display-Selektion als Ausgangspunkt für die Entwicklung von Peptidmedikamenten gegen die beiden Zielkrankheiten, die Parkinson-Krankheit (PD) und die Coronavirus-Erkrankung 2019 (COVID-19), durchgeführt. PD ist die weltweit am häufigsten auftretende neurodegenerative Bewegungsstörung. Ein zentrales Merkmal ist die fortschreitende Degeneration dopaminerger Neuronen, die mit der Ansammlung von zytosolischen Einschlüssen, den so genannten Lewy-Körpern, einhergeht. Diese bestehen größtenteils aus dem präsynaptisch gelegenen, physiologisch intrinsisch ungefaltetem und monomeren Protein alpha-Synuclein (α-syn), das unter krankheitsfördernden Bedingungen mit sich selbst assoziiert und sich in strukturierten Biopolymeren, den sogenannten Fibrillen, ablagert. Bei der Aggregation von α syn werden lösliche Oligomere gebildet, die als Schlüsselfaktor für die Neurodegeneration gelten. Darüber hinaus wird angenommen, dass sich Prionen-ähnliche α-syn-Strukturen zwischen Zellen ausbreiten und in den Empfängerzellen Aggregation auslösen können, was letztlich zur Ausbreitung der Neuropathologie und zum Fortschreiten der Krankheit führt. In dieser Arbeit wurde ein Spiegelbild Phagen-Display gegen das Volllängen D-Enantiomer von α-syn durchgeführt, um vollständig D-Enantiomere-Peptide zu identifizieren, die mit hoher Affinität an das unstrukturierte Monomer binden und dadurch den physiologischen Zustand stabilisieren sowie Aggregation verhindern. Darüber hinaus wurden erste Sequenzoptimierungen im Hinblick auf die Eigenschaft untersucht, α-syn-Oligomere zu eliminieren und somit das aktive Monomer wiederherzustellen. Eine weitere in dieser Arbeit behandelte Zielkrankheit wird durch das Beta-Coronavirus schweres respiratorisches Syndrom Coronavirus 2 (SARS CoV-2) verursacht, das 2019 erstmals in Wuhan (China) identifiziert wurde. Die hohe Übertragungseffizienz zwischen Menschen hat zu einer weltweiten Pandemie geführt, wobei die Krankheit vor allem die oberen Atemwege sowie das Lungenepithel befällt. Schwere Verläufe der Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID 19) können zu systemischen Entzündungsreaktionen und schließlich zu Multiorganversagen (MOF) führen. Der Replikationszyklus von SARS-CoV-2 ist ein mehrstufiger Prozess, der durch den Zellkontakt des viralen Spike-Proteins und des humane Angiotensin-konvertierende Enzyme 2 (hACE2) eingeleitet wird. Um eine Grundlage für das nachfolgende Projekt zu schaffen, wurde die Interaktion des SARS-CoV-2-Spike-Proteins mit hACE2 in einem separaten Projekt zunächst kinetisch charakterisiert, wobei ein sekundärer Bindungszustand innerhalb des bereits gebildeten Komplexes identifiziert werden konnte. Dieser erhöht die Affinität des Virus an der Zelloberfläche und ist ein potenzieller Faktor, der bei den derzeit zirkulierenden besorgniserregenden Varianten (VOC) moduliert werden kann. Auf Basis dieser Erkenntnisse wurde eine Phage-Display-Selektion an der Rezeptorbindungsdomäne (RBD) des SARS-CoV-2-Spike-Proteins durchgeführt, um Peptidliganden zu identifizieren, die die Assoziation mit hACE2 blockieren und den Rezeptor aus dem bereits gebildeten Komplex verdrängen könnten. Zu diesem Zweck wurde die Interaktionskinetik der Peptide mit dem Spike-Protein untersucht und im Hinblick auf die Hemmung der hACE2-Bindung validiert. Rationales Design unter Verwendung der Kombination von Sequenzen in divalenten Ansätzen führte zu verbesserten Hemmwirkungen. Um die zuvor erwähnten Projekte anzugehen, wurde ein neuartiges Phagen-Display-Selektionsprotokoll entwickelt, das Kontrollselektionen sowie eine auf Next Generation Sequencing (NGS) basierende Sequenzanalyse vorsieht, um speziell Sequenzvarianten zu identifizieren, die eine Bindung an das jeweilige Zielprotein aufweisen. Dieses Protokoll wurde auch auf die Zielproteine SARS-CoV-2 3C ähnliche Protease (3CLpro, COVID-19) und hSOD1 (humane Superoxid-Dismutase, amyotrophe Lateralsklerose (ALS)) in separaten Projekten angewendet. Auch hier führte das Screening-Protokoll zur Identifizierung von Peptidliganden, die nach entsprechender Optimierung für den therapeutischen Einsatz in Frage kommen. Zusätzlich wird, durch die Verwendung von fibrillärem α-syn als Zielstruktur, die Entwicklung von Peptidliganden für diagnostische Zwecke demonstriert. Zusammenfassend ermöglichen die kombinierten Ergebnisse der verschiedenen Projekte die Ableitung eines allgemeinen Ansatzes für die Entwicklung therapeutischer und diagnostischer Peptidliganden.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	23.02.2023
Dateien geändert am:	23.02.2023
Promotionsantrag am:	28.07.2022
Datum der Promotion:	14.02.2023