Dokument: Dissecting iron and heme regulatory networks and adaptation to heme stress in Corynebacterium glutamicum

Titel:	Dissecting iron and heme regulatory networks and adaptation to heme stress in Corynebacterium glutamicum
Weiterer Titel:	Entschlüsselung von Eisen- und Häm-Regulationsnetzwerken und Anpassung an Häm-Stress in Corynebacterium glutamicum
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61997
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230317-084154-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Krüger, Aileen [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 54,19 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.02.2023 / geändert 14.02.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Frunzke, Julia [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Transcription factors enable organisms to modulate the expression of numerous genes in response to different environmental stimuli. They are embedded in complex and sophisticated regulatory networks to ensure balanced responses and survival in fluctuating environments. The aim of this doctoral thesis was to enlarge the knowledge on corynebacterial iron and heme regulatory networks, their interactions and their plasticity in response to stress. The trace element iron is vital for almost every cellular organism acting in various essential biological processes, like electron transport, tricarboxylic acid cycle or peroxide reduction. An important form of bound iron is the porphyrin structure heme. Besides its role as alternative iron resource in iron-scarce environments, heme serves as the prosthetic group of several critical proteins like cytochromes, hydroxylases or catalases. Despite being essential for survival, a certain toxicity is associated with iron and heme at elevated levels inter alia caused by the generation of oxidative stress via Fenton reaction. With the intention to maintain robust iron and heme homeostasis, the Gram-positive soil bacterium Corynebacterium glutamicum relies on a transcriptional network comprised of the master regulator of iron DtxR and the paralogous heme-responsive two-component systems HrrSA and ChrSA. While HrrSA represents a global regulatory system of heme homeostasis, ChrSA is specific for heme detoxification by regulating the expression of the heme exporter HrtBA. In the framework of this doctoral thesis, in vivo genome-wide profiling of DtxR binding sites confirmed many targets known from in vitro data, but further expanded the repertoire of DtxR targets by genes involved in DNA recombination, methionine synthesis and oxidative stress as well as several prophage genes. Remarkably, binding was illustrated to be dependent from the iron source present and a similar observation was made when deciphering conditional and time-resolved binding patterns of HrrA. Here, identification of more than 200 target genes of inter alia heme biosynthesis, respiratory chain, oxidative stress or cell envelope remodeling unraveled HrrA as global regulator of heme homeostasis. Strikingly, a significant anti-proportional correlation of binding peak intensity and the differential gene expression was determined for both DtxR and HrrA data sets, i.e. weaker binding correlated with a higher differential gene expression in strains lacking the respective regulator. Furthermore, this comparative, genome-wide approach led to the identification of several shared targets of DtxR and HrrA underlining the interconnection of these two global regulatory networks. Focusing on heme, this study further aimed at the examination of strategies applied by C. glutamicum to cope with heme toxicity. An adaptive laboratory evolution experiment towards heme tolerance resulted in an evolved strain carrying a beneficial frameshift mutation in the catalytical domain of the histidine kinase ChrS, yielding a pseudokinase variant. This strain had an exceptionally elevated heme tolerance provided by highly increased expression of hrtBA encoding a conserved heme exporter, which was shown to be crucial for heme detoxification. Expression of hrtBA is mediated by the response regulator ChrA, but different from the native context, the phosphorylation of ChrA in the evolved strain is completely dependent on the paralogous non-cognate histidine kinase HrrS. This activation is presumably enforced by the pseudokinase variant of ChrS. Thus, adaptation to elevated heme levels occurred via altered communication between the paralogous two-component systems (TCSs) HrrSA and ChrSA. Apart from that, another regulatory layer on the histidine kinase level by heterodimerization of native ChrS and HrrS could be revealed within this study. Moreover, additional minor heme detoxification strategies were postulated, like sequestration via heme binding proteins or alternate transport to counteract toxicity. In conclusion, this thesis provides comprehensive insights into the control of iron and heme homeostasis by the global transcriptional regulators DtxR and HrrA. The presented results emphasize the importance of in vivo genome-wide binding analyses to decipher interactions and interference between global regulatory networks. Furthermore, adaptive laboratory evolution experiments revealed the high evolutionary plasticity of TCSs cascades composed of paralogous systems, as exemplified by HrrSA and ChrSA, facilitating the rapid adaptation to environmental stresses. Transkriptionsfaktoren ermöglichen es Organismen, die Expression zahlreicher Gene als Reaktion auf verschiedene Umweltreize zu modulieren. Integriert in komplexe regulatorische Netzwerke gewährleisten sie angepasste Reaktionen sowie das Überleben in fluktuierenden Umgebungen. Ziel dieser Doktorarbeit war es, die Eisen- und Häm-Regulationsnetzwerke von Corynebakterien, ihre Interaktionen und ihre Flexibilität als Reaktion auf Stress tiefergehend zu analysieren. Das Spurenelement Eisen ist für nahezu jeden zellulären Organismus lebensnotwendig, da es an verschiedenen essentiellen biologischen Prozessen beteiligt ist, wie dem Elektronentransport, dem Tricarbonsäurezyklus oder der Peroxidreduktion. Eine wichtige Form von gebundenen Eisen ist die Porphyrinstruktur Häm. Neben der Rolle als alternative Eisenquelle in eisenarmen Umgebungen dient Häm als prosthetische Gruppe für wichtige Proteine wie Cytochrome, Hydroxylasen oder Katalasen. Obwohl Eisen und Häm essentiell für das zelluläre Überleben sind, wird eine gewisse Toxizität mit erhöhten Konzentrationen assoziiert, die unter anderem durch die Erzeugung von oxidativem Stress über die Fenton-Reaktion verursacht wird. Um eine robuste Eisen- und Häm-Homöostase aufrechtzuerhalten, nutzt das Gram-positive Bodenbakterium Corynebacterium glutamicum ein Transkriptionsnetzwerk, das aus dem globalen Regulator für Eisen DtxR und den paralogen Zwei-Komponenten-Systemen HrrSA und ChrSA besteht. Während HrrSA ein globales Regulationssystem der Häm-Homöostase darstellt, ist ChrSA spezifisch für die Häm-Detoxifizierung, indem es die Expression des Häm-Exporters HrtBA reguliert. Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden durch genomweite in vivo-Analysen der DtxR-Bindungsstellen viele bekannte genetische DtxR-Ziele aus in vitro-Daten bestätigt und zusätzlich das Repertoire der DtxR-Ziele um Gene erweitert, die an der DNA-Rekombination, der Methionin Synthese und dem oxidativen Stress beteiligt sind, sowie auch mehrere Prophagen-Gene. Bemerkenswerterweise zeigte sich, dass die Bindung von der vorhandenen Eisenquelle abhängt, was in vergleichbarer Weise ebenfalls bei der Entschlüsselung des HrrA-Bindemusters beobachtet wurde. Durch die Identifizierung von mehr als 200 Zielgenen, unter anderem für die Häm-Biosynthese, die Atmungskette, oxidativen Stress oder der Remodellierung der Zellhülle, konnte HrrA als globaler Regulator der Häm-Homöostase entschlüsselt werden. Auffallend ist, dass sowohl für die DtxR- als auch für die HrrA-Datensätze eine signifikante anti-proportionale Korrelation zwischen der Intensität der Bindungsmaxima und der differentiellen Genexpression festgestellt wurde, d.h. eine schwächere Bindung korrelierte mit einer höheren differentiellen Genexpression in Stämmen, denen der jeweilige Regulator fehlte. Darüber hinaus führte dieser vergleichende, genomweite Ansatz zur Identifizierung mehrerer gemeinsamer genetischer Ziele von DtxR und HrrA, was die Verflechtung dieser beiden globalen regulatorischen Netzwerke unterstreicht. Des Weiteren konzentrierte sich diese Studie auf Häm und untersuchte die Strategien, die C. glutamicum anwendet, um mit der Häm-Toxizität umzugehen. Ein adaptives Laborevolutionsexperiment in Richtung Häm-Toleranz erzielte einen evolvierten Stamm mit einer vorteilhaften Mutation, welche zu einer Leseraster Verschiebung in der katalytischen Domäne der Histidinkinase ChrS führte und diese zu einer Pseudokinase-Variante machte. Dieser Stamm wies eine außergewöhnlich hohe Häm-Toleranz auf, die durch eine stark erhöhte Expression von hrtBA erreicht wurde. Dieses Gen kodiert für einen konservierten Häm-Exporter, der sich als entscheidend für die Häm-Detoxifizierung erwiesen hat. Die Expression von hrtBA wird durch den Antwortregulator ChrA kontrolliert, aber anders als im nativen Kontext ist die Phosphorylierung von ChrA in dem evolvierten Stamm vollständig von der paralogen Histidinkinase HrrS abhängig. Diese Aktivierung wird vermutlich durch die ChrS Pseudokinase-Variante begünstigt. Die Anpassung an einen erhöhten Häm-Gehalt erfolgte demnach über eine veränderte Kommunikation zwischen den paralogen Zwei-Komponenten-Systemen HrrSA und ChrSA. Darüber hinaus konnte in dieser Studie eine weitere regulatorische Komponente auf der Ebene der Histidinkinasen durch Heterodimerisierung von nativem ChrS und HrrS aufgedeckt werden. Ferner wurden weitere zusätzliche Häm-Detoxifizierungsstrategien postuliert, wie z.B. Sequestrierung durch Häm-bindende Proteine oder alternativer Transport, um der Toxizität entgegenzuwirken. Zusammenfassend bietet diese Arbeit umfassende Einblicke in die Kontrolle der Eisen- und Häm-Homöostase durch die globalen Transkriptionsregulatoren DtxR und HrrA. Die vorgestellten Ergebnisse unterstreichen die Wichtigkeit genomweiter in-vivo-Bindungsanalysen zur Entschlüsselung von Interaktionen und Interferenzen zwischen globalen regulatorischen Netzwerken. Darüber hinaus zeigten Experimente zur adaptiven Laborevolution die hohe evolutionäre Plastizität von Zwei-Komponenten-System-Kaskaden, die aus paralogen Systemen bestehen, wie z. B. HrrSA und ChrSA, welche eine schnelle Anpassung an Stressbedingungen ermöglichen.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	17.03.2023
Dateien geändert am:	17.03.2023
Promotionsantrag am:	26.10.2022
Datum der Promotion:	16.01.2023