Dokument: Die pharmakologische Inhibition epigenetischer Regulatoren als Alternative zur Standardtherapie für (Cisplatin-resistente) Keimzelltumoren

Titel:	Die pharmakologische Inhibition epigenetischer Regulatoren als Alternative zur Standardtherapie für (Cisplatin-resistente) Keimzelltumoren
Weiterer Titel:	The pharmacological inhibition of epigenetic regulators as an alternative to the standard therapy for (cisplatin-resistant) germ cell tumors
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61909
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230206-104826-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Müller, Melanie Rita [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 21,24 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 01.02.2023 / geändert 01.02.2023
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Nettersheim, Daniel [Gutachter] Prof. Dr. Kurz, Thomas [Gutachter]
Stichwörter:	Keimzelltumore, Epigenetik, HDAC, germ cell tumor
Dokumententyp (erweitert):	Dissertation
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Keimzelltumoren (KZT) des Mannes sind vor allem eine Erkrankung junger Männer im Alter zwischen 10 und 40 Jahren. Die Tumoren werden in verschiedene Entitäten unterteilt: Seminome (SE) und Nicht-Seminome (NSE). Letztere werden weiter in Embryonalkarzinome (EC), Dottersacktumoren (YST), Chorionkarzinome (CC) und Teratome (TE) unterschieden, wobei auch gemischte Typen auftreten können. Die Heilungschancen dieser Erkrankung mit der Standardtherapie, bestehend aus Strahlungstherapie oder Cisplatin-basierter Chemotherapie sind sehr gut. Bei Rezidiven und Cisplatin-resistenten Tumoren gibt es jedoch keine alternativen Therapien neben einer Hochdosis-Chemotherapie. Zusätzlich sind die nach Cisplatin-Behandlung häufig beobachteten Langzeittoxizitäten, allen voran Sekundärtumoren, in diesen jungen Patienten mit guter Prognose und geringer Einschränkung der Lebenserwartung ein Problem. Aus diesen Gründen werden dringend alternative Strategien zur Behandlung (Cisplatin-resistenter) KZT benötigt. KZT weisen nur selten genomische Mutationen auf, weswegen eine gestörte Epigenetik als Ursache für die Entartung der Keimzellen vermutet wird. Die Epigenetik ist die Regulierung der Genexpression, welche durch Transkription-aktivierende und -reprimierende Histon- und DNA-Modifikationen etabliert wird. Der Eingriff in dieses in KZT bereits instabile Netzwerk durch Inhibitoren gegen epigenetische Modifikatoren und Interaktoren kann daher als Therapieziel genutzt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Eignung verschiedener, epigenetisch wirkender Agenzien (Epi-Drugs) als Therapieoption in (Cisplatin-resistenten) KZT-Zellen getestet. Dafür wurden, basierend auf Transkriptomanalysen von KZT-Zelllinien- und -Gewebe, epigenetische Interaktoren verschiedener Enzymklassen als potenzielle Ziele identifiziert und passende Inhibitoren ausgewählt. Der Einfluss dieser Inhibitoren auf die Zellviabilität wurde zunächst in drei verschiedenen KZT-Zelllinien, jeweils eine Zelllinie der Entitäten SE, EC und CC getestet. Hier konnten vier Epi-Drugs mit Reduktion der Zellviabilität im nanomolaren Konzentrationsbereich identifiziert werden: Histondeacetylaseinhibitor (HDACi) Quisinostat, Histondemethylaseinhibitor JIB 04, Histonmethyltransferaseinhibitor Chaetocin und PROTAC MZ 1, welcher gegen Acetylmodifikationen erkennende Proteine gerichtet ist. Weitere drei Epi-Drugs zeigten Wirkspektren im niedrigen mikromolaren Konzentrationsbereich: LP99, ebenfalls ein Inhibitor gegen Acetylmodifikationen erkennende Proteine, und Polycomb-repressive-Complex-Inhibitoren PRT4165 und GSK343. Anschließend wurde die zytotoxische Analyse dieser sieben Epi-Drugs auf weitere KZT-Zelllinien ausgedehnt, einschließlich Cisplatin-resistenter Subklone, und die molekulare Wirkung genauer analysiert. Mittels Durchflusszytometrie wurde die Induktion von Apoptose und Zellzyklusarresten ermittelt. Massenspektrometrisch wurden die durch die Epi-Drugs induzierten Änderungen der Histonmodifikationen analysiert. Hier konnte gezeigt werden, dass zusätzlich zu den durch die Inhibition der Zielenzyme erwarteten Änderungen auch epigenetische Nebeneffekte auf andere Histonmodifikationen, sowie auf die DNA-Methylierung auftraten. Des Weiteren wurden die Effekte der verschiedenen Epi-Drugs auf das Transkriptom mittels RNA-Sequenzierung untersucht. Dies zeigte, dass der Eingriff in die epigenetische Landschaft von KZT vor allem zur Deregulation von Ionentransportern und DNA-bindenden Faktoren führte. Mit einem Kinase-Array wurde zudem eine Deregulation verschiedener Kinase-Signalwege wie cAMP, JAK-STAT und WNT durch die Epi-Drugs identifiziert. Zusätzlich wurde die bei HDAC-Inhibition identifizierte stark erhöhte DHRS2-Expression genauer untersucht. Die NADPH-abhängige Reduktase DHRS2 kann im Zellkern und in den Mitochondrien vorkommen und hat je nach Lokalisation vermutlich unterschiedliche Funktionen. Um einen ersten Einblick in die Funktion von DHRS2 im Wirkspektrum der HDACi zu erhalten, wurde in dieser Arbeit zunächst die Expression der verschiedenen DHRS2-Isoformen untersucht. Durch verschiedene getestete HDACi wurden vor allem die beiden proteinkodierenden DHRS2-Isoformen 5 und 7, welche ein Mitochondrientranslokationssignal im N-Terminus beinhalten, vermehrt exprimiert. Es wurde jedoch auch eine stark erhöhte Expression der nicht-proteinkodierenden Isoformen 8 und 9 nach HDACi-Behandlung beobachtet, über deren Funktion noch nichts bekannt ist. Zusammenfassend konnten durch umfangreiche zytotoxische und molekulare Analysen sieben verschiedene Epi-Drugs für eine alternative oder zusätzliche Therapieoption zur Standardtherapie zur Behandlung von (Cisplatin-resistenten) KZT identifiziert und deren Wirkspektrum durch molekulare Untersuchungen charakterisiert werden. Germ cell tumors (GCTs) in males are preeminently a disease of young men aged 10 to 40 years. GCTs are divided into the subtypes seminoma (SE) and non-seminoma (NSE), the latter being further divided into embryonal carcinoma (EC), yolk sac tumor (YST), choriocarcinoma (CC) and teratoma (TE). Mixed types, consisting of two or more different subtypes have also been reported. The standard therapy, consisting of radiation or Cisplatin-based chemotherapy provides very good chances of recovery. Although recurring cancer and gaining of Cisplatin-resistance are more problematic, as there are as of now no alternative treatment options for GCTs except salvage chemotherapy. Especially in these young patients with good prognosis and therefore a good life expectancy, the long-term toxicities like secondary tumors, which often succeed Cisplatin-based treatments are problematic. For those reasons, alternative strategies for the treatment of (Cisplatin-resistant) GCTs are urgently needed. As GCTs have a very low mutation burden compared to other tumor entities, the cause of the maldevelopment of the germ cells is thought to originate in a disturbed epigenetic landscape. The term epigenetics refers to the regulation of gene expression carried out by transcription activating and repressing histone and DNA modifications. Further violation of this already destabilized regulatory network by the inhibition of epigenetic modifiers and interactors can be used as a therapeutical target in GCTs. The aim of this thesis was to determine the suitability of different epigenetically active drugs (Epi-Drugs) as a therapeutical option for (Cisplatin-resistant) GCTs. The selection of suitable epigenetic targets and corresponding drugs was based on transcriptome data of GCT cell lines and tissues. The effect on the cell viability of these Epi-Drugs was first tested in three different GCT cell lines, one from each entity SE, EC and CC. Four Epi-Drugs induced a reduction of the cell viability in a nanomolar concentration range: histone deacetylase inhibitor (HDACi) Quisinostat, histone demethylase inhibitor JIB-04, histone methyltransferase inhibitor Chaetocin and PROTAC MZ-1 which targets proteins recognizing acetylated histones. Further, LP99, also an inhibitor of proteins recognizing acetylated histones, as well as PRT4165 and GSK343, both inhibitors of polycomb repressive complexes, effectively decreased cell viability using concentrations in the lower micromolar range. The cytotoxic testing of these seven Epi-Drugs was extended to additional GCT cell lines, including Cisplatin-resistant subclones, followed by the characterization of the molecular effects induced by the treatments. The induction of apoptosis and cell cycle arrests was determined using flow cytometry. The changes in histone modifications caused by the inhibition of the epigenetic targets were observed using mass spectrometry. Remarkably, in addition to the expected changes caused by the inhibition, further changes concerning different histone modifications were found. These epigenetic side effects included histone modifications as well as methylation of the DNA. In addition, effects of the Epi-Drugs on the transcriptome were observed using RNA sequencing, revealing that modulation of the epigenetic landscape results in deregulation of ion transporters and DNA-binding factors in GCT cells. Finally, the activation of kinase signaling pathways was analyzed using a kinase array, providing evidence for the deregulation of the cAMP, JAK-STAT and WNT signaling pathways. The inhibition of HDACs lead to a strong increase in DHRS2 expression, which was further analyzed in the scope of this work. DHRS2 is a NADPH-dependent reductase located in the nucleus or the mitochondria. There is not much known about the function of DHRS2, but it seems to differ depending on its localization. In order to gain a first insight into the function of DHRS2 in the mode of action of HDACi, the expression of the different isoforms of DHRS2 were analyzed. The treatment with different HDACi mainly increased the expression of the protein coding DHRS2 isoforms 5 and 7, containing the mitochondrial translocation signal. In addition, the expression of the non-coding isoforms 8 and 9 was also increased. A potential function of these non-coding isoforms is not yet known. In conclusion this thesis identified seven Epi-Drugs as an alternative treatment option for the therapy of (Cisplatin-resistant) GCTs using extensive cytotoxic and molecular analyses to further characterize their mode of action.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	06.02.2023
Dateien geändert am:	06.02.2023
Promotionsantrag am:	04.10.2022
Datum der Promotion:	23.01.2023