Dokument: Inhibition des IL-6 Trans Signaling durch Nanobody-Fusionsproteine
| Titel: | Inhibition des IL-6 Trans Signaling durch Nanobody-Fusionsproteine | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61826 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20230216-113043-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dambietz, Christine Anna [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. rer. nat. Scheller, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. med. Hauer, Julia [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Interleukin 6 ist ein zentrales Zytokin im menschlichen Organismus und besitzt ein breites Spektrum immunologischer, hämatopoetischer und metabolischer Funktionen. IL-6 Signal- transduktion wird über einen spezifitätsvermittelnden α-Rezeptor (IL-6Rα) und einen signal- transduzierenden ß-Rezeptor, das ubiquitär exprimierte Glykoprotein 130, vermittelt. Der klas- sische IL-6 Signalweg ist auf die Zelltypen mit membranständigem IL-6R, z.B. Makrophagen und Hepatozyten, beschränkt. Neben dem membranösen IL-6R existiert auch eine lösliche Re- zeptorform (sIL-6R). Der Signalweg über den löslichen Rezeptor wird als Trans Signaling be- zeichnet und kann in sämtlichen gp130-tragenden Zellen Signalkaskaden induzieren. Interes- santerweise unterscheiden sich die Phänotypen von IL-6 Classic Signaling und Trans Signaling grundlegend. Die Einleitung der Akute-Phase-Reaktion und regenerative Prozesse werden hauptsächlich mit dem klassischen IL-6 Signalweg verbunden, während autoimmune Prozesse, chronisch entzündliche oder auch maligne Erkrankungen häufiger mit IL-6 Trans Signaling assoziiert werden.
In dieser Arbeit wurden diverse IL-6 Inhibitoren etabliert. Die cs-130Fc Varianten, Fusionspro- teine bestehend aus den D1-D3-Domänen des gp130 und einem Nanobody, wurden stabil in adhärente chinesische Hamster Ovarialzellen (CHO-K1) transfiziert und in großen Mengen produziert. Mittels Oberflächenplasmonenresonanz, Proliferations- sowie Stimulationsassays wurden die cs-130Fc Varianten funktionell charakterisiert. Cs-130Fc und cs-130 erwiesen sich als spezifische Inhibitoren des IL-6 Trans Signaling. Durch die Integration des VHH6 Nanobo- dys konnte die Spezifität für IL-6 gesteigert werden. Im direkten Vergleich zu dem bisher etab- lierten Inhibitor sgp130Fc zeigte das Dimer cs-130Fc in in vitro Experimenten eine höhere Spezifität und Effizienz der IL-6 Trans Signaling Inhibition. Des Weiteren wurden IL-6-Mu- teine zur spezifischen Inhibition der IL-6 Signaltransduktion generiert. Dabei handelt es sich um Fusionsproteine aus IL-6-Muteinen und einem Nanobody. Durch Mutationen in Site III und Site II des IL-6 wurde die Bindefähigkeit für das Glykoprotein 130 reduziert bzw. eliminiert, während die Interaktion zwischen Site I des IL-6 und seinem löslichen Rezeptor (sIL-6R) er- halten blieb. Auf diese Weise kann der sIL-6R gebunden werden, ohne eine intrazelluläre Sig- nalkaskade in Gang zu setzen. In dieser Arbeit wurden verschiedene IL-6-Mutationsvarianten kloniert. Exemplarisch wurde das Fusionsprotein aus W157R/D160R (IL-6-Mutein) und dem VHH6 Nanodybody stabil in CHO-K1 transfiziert, in größerem Maßstab produziert und gerei- nigt. Eine erste Testung der inhibitorischen Aktivität erfolgte im Proliferationsassay.Interleukin 6 plays a central role as a cytokine in human, it covers a variety of immunologic, hematopoietic and metabolic functions. IL-6 signaling is induced by a specific α-receptor (IL- 6R) and a signal-inducing ß-receptor, the ubiquitously expressed glycoprotein 130 (gp130). Classic IL-6 Signaling is limited to cells with a membranous IL-6R, i.e. macrophages and hepatocytes. Besides, there is a soluble form of the IL-6 receptor (sIL-6R) that was found in human serum. IL-6 signaling taking place through the sIL-6R is called trans signaling and oc- curs potentially in all cells that carry gp130 on their cell membrane. The phenotype of the clas- sic signaling pathway and trans signaling differ from each other. Whereas IL-6 classic signal- ing covers important physical functions as the production of acute phase proteins or tissue re- generation, IL-6 trans signaling is more often associated with pathological processes, i.e. chronic inflammation, autoimmune diseases or malignancies. In this dissertation we established diverse IL-6 inhibitors. cs-130Fc variants are fusion proteins made up of the D1-D3 domains of gp130 and a nanobody. They were stably transfected into Chinese hamster ovary cells (CHO-K1) and produced in a large scale (mg). These new inhibi- tors were characterized by using surface plasmon resonance spectroscopy, proliferation assays and stimulation assays. cs130Fc and cs130 proved to be specific inhibitors of IL-6 trans sig- naling. The specificity for IL-6 trans signaling was increased by integrating the VHH6 nano- body which binds to and stabilizes the IL-6/sIL-6R complex. In comparison to sgp130Fc, an IL-6 trans signaling inhibitor which was recently tested in phase II clinical studies, cs130Fc showed higher specificity and efficiency to inhibition of IL-6 trans singling in in vitro experi- ments. In another project, IL-6 muteins were created for specific IL-6 signaling inhibition. Those variants are made up of an IL-6 mutein fused to a nanobody. Their binding capacity to gp130 was reduced or eliminated by site III and site II mutations of IL-6. Site I was not touched, so the interaction in between IL-6 and the sIL-6R was not disturbed and IL-6 could bind to the soluble receptor without inducing an intracellular signaling cascade. In this dissertation, a vari- ety of IL-6 muteins was cloned. The fusion protein with W157R/D160R mutation was stably transfected into CHO-K1 cells and produced in a large scale. So far, the inhibitory activity of the W157R/D160R variant to IL-6 trans signaling was tested in proliferation assays. | |||||||
| Lizenz: |  Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung 4.0 International Lizenz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.02.2023 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.02.2023 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.01.2022 | |||||||
| Datum der Promotion: | 08.12.2022 |
