Dokument: Novel insights into the functioning and regulation of FER-LIKE IRON DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR (FIT) on post-translational and subcellular level

Titel:	Novel insights into the functioning and regulation of FER-LIKE IRON DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR (FIT) on post-translational and subcellular level
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61814
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230125-132105-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Trofimov, Ksenia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 48,40 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.01.2023 / geändert 23.01.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Bauer, Petra [Gutachter] PD Dr. Stahl, Yvonne [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 580 Pflanzen (Botanik)
Beschreibungen:	Iron is an essential micronutrient for animals and plants. Within iron uptake in plants, an important protein is the basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factor (TF) FER-LIKE IRON DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR (FIT). Together with an interaction partner, such as bHLH039, FIT is upregulating gene transcription of the iron uptake machinery upon iron deficiency. Iron uptake has to be tightly regulated to avoid deficiency or excess. Thus, regulation of FIT activity is an important step in balancing the uptake. It was proposed that FIT exists in two pools within the cell, an active and an inactive pool, but FIT regulation was mainly described in the context of protein turnover. Therefore, an important question to answer is how FIT is activated and deactivated to regulate iron uptake. Identification of a protein kinase interacting with FIT opened the possibility of FIT being phosphorylated. Therefore, one aim of this work was to investigate the influence of phosphorylation on FIT activity. Apart from this, the subcellular localization of FIT and other TFs involved in iron uptake was barely in focus of research, missing out on valuable information on an additional regulatory level. Another aim was therefore to investigate the subcellular localization of TFs involved in iron uptake regulation in more detail. In my dissertation, I contributed to show that FIT activity was dually regulated via phosphorylation. Ser271/272 was identified as an important phosphorylation site for FIT activation, and I could show that upon mutation to a phospho-dead FIT form, this mutant FIT showed reduced homo- and heterodimerization with bHLH039 compared to wild-type FIT. The phospho-dead FIT form was not able to complement fit mutant plants and showed altered localization and protein mobility. In further work, we predicted other phosphorylation sites and showed that phosphorylation of Tyr residues deactivated FIT and subjected it to proteasomal degradation. Phospho-mimicking tyrosine mutants showed altered localization, protein mobility, and promoter transactivation activity. Also here, I could show that FIT mutants had altered homo- and heterodimerization capacity with bHLH039 compared to wild-type FIT. Iron uptake regulation could be further refined on subcellular level. As a result of an extensive microscopy study, I identified that bHLH039 was nucleocytoplasmically partitioned depending on FIT. In absence of FIT, bHLH039 was retained in cytoplasmic foci. With FIT, bHLH039 localized in the nucleus. Furthermore, I found that FIT underwent condensation within the nucleus upon a light stimulus. The formation of these nuclear bodies (NBs) functioned as a hub for FIT homo- and heterodimerization with bHLH039. Additionally, colocalization studies pointed at a possible transcriptional or post-transcriptional function of these FIT NBs. This work provides detailed insight into finetuning of FIT activity via a dual post-translational regulation in form of phosphorylation and uncovers the dynamic subcellular localization of FIT and its interaction partner bHLH039. Eisen ist ein essenzieller Mikronährstoff für Tiere und Pflanzen. Ein wichtiges Protein bei der Eisenaufnahme in Pflanzen ist der basic helix-loop-helix (bHLH) Transkriptionsfaktor (TF) FER-LIKE IRON DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR (FIT). Zusammen mit einem Interaktionspartner wie bHLH039 reguliert FIT die Gentranskription der Eisenaufnahmemaschinerie bei Eisenmangel hoch. Die Eisenaufnahme muss streng reguliert werden, um einen Mangel oder Überschuss zu vermeiden. Daher ist die Regulierung der FIT-Aktivität ein wichtiger Schritt, um die Aufnahme auszugleichen. Es wurde vorgeschlagen, dass FIT in zwei Pools innerhalb der Zelle existiert, einem aktiven und einem inaktiven Pool, aber die FIT-Regulierung wurde hauptsächlich im Zusammenhang mit Proteinumsatz beschrieben. Daher ist eine wichtige zu beantwortende Frage, wie FIT aktiviert und deaktiviert wird, um die Eisenaufnahme zu regulieren. Die Identifizierung einer Proteinkinase, die mit FIT interagiert, eröffnete die Möglichkeit, dass FIT phosphoryliert wird. Daher war ein Ziel dieser Arbeit, den Einfluss der Phosphorylierung auf die FIT-Aktivität zu untersuchen. Abgesehen davon stand die subzelluläre Lokalisierung von FIT und anderen an der Eisenaufnahme beteiligten TF kaum im Fokus der Forschung, wodurch wertvolle Informationen auf einer zusätzlichen regulatorischen Ebene ausgelassen wurden. Ein weiteres Ziel war es daher, die subzelluläre Lokalisation von TF, die an der Regulation der Eisenaufnahme beteiligt sind, genauer zu untersuchen. In meiner Dissertation habe ich dazu beigetragen zu zeigen, dass die FIT-Aktivität dual über Phosphorylierung reguliert wird. Ser271/272 wurde als wichtige Phosphorylierungsstelle für die FIT-Aktivierung identifiziert, und ich konnte zeigen, dass nach Mutation zu einer nicht phosphorylierbaren FIT-Form, das mutierte FIT im Vergleich zu Wildtyp-FIT eine reduzierte Homo- und Heterodimerisierung mit bHLH039 zeigte. Die nicht phosphorylierbare FIT-Form war nicht in der Lage, mutante fit-Pflanzen zu komplementieren und zeigte eine veränderte Lokalisierung und Proteinmobilität. Des Weiteren sagten wir andere Phosphorylierungsstellen voraus und zeigten, dass die Phosphorylierung von Tyrosinresten FIT deaktivierte und zu einem proteasomalen Abbau führte. Phosphorylierungsnachahmende Tyrosin-Mutanten zeigten eine veränderte Lokalisierung, Proteinmobilität und Promotor-Transaktivierungsaktivität. Auch hier konnte ich zeigen, dass FIT Mutanten eine veränderte Homo- und Heterodimerisierungsfähigkeit mit bHLH039 im Vergleich zu Wildtyp-FIT aufwiesen. Die Regulierung der Eisenaufnahme könnte auf subzellulärer Ebene weiter verfeinert werden. Als Ergebnis einer umfangreichen Mikroskopiestudie identifizierte ich, dass bHLH039 in Abhängigkeit von FIT nukleozytoplasmatisch partitioniert war. In Abwesenheit von FIT wurde bHLH039 in zytoplasmatischen Foci zurückgehalten. Mit FIT lokalisierte bHLH039 im Zellkern. Außerdem fand ich heraus, dass FIT bei einem Lichtreiz im Zellkern kondensierte. Die Bildung dieser Kernkörperchen fungierte als Zentrum für die FIT Homo- und Heterodimerisierung mit bHLH039. Zusätzlich wiesen Kolokalisierungsstudien auf eine mögliche transkriptionelle oder post-transkriptionelle Funktion dieser FIT-Kernkörperchen hin. Diese Arbeit bietet detaillierte Einblicke in die Feinjustierung der FIT-Aktivität über eine duale post-translationale Regulation in Form von Phosphorylierung und deckt die dynamische subzelluläre Lokalisierung von FIT und seinem Interaktionspartner bHLH039 auf.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung - Nicht kommerziell - Keine Bearbeitungen 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Botanik
Dokument erstellt am:	25.01.2023
Dateien geändert am:	25.01.2023
Promotionsantrag am:	02.11.2022
Datum der Promotion:	21.12.2022