Dokument: Investigation of the modification enzymes and the impact of mutations within the lantibiotic nisin

Titel:	Investigation of the modification enzymes and the impact of mutations within the lantibiotic nisin
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=61717
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20230119-112033-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Reiners, Jens [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 111,03 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.01.2023 / geändert 16.01.2023
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Nisin A ist das Model Peptid für Lantibiotika. Seit seiner Entdeckung vor fast 100 Jahren wurden viele Nisin Varianten identifiziert und untersucht. Nisin A wird als Pre-peptid exprimiert und posttranslational modifiziert. Dies geschieht über die Modifikationsenzyme NisB, verantwortlich für die Dehydratisierung der Serin und Threonin Reste im Kernpeptide, und der Zyklase NisC die mittels einer Michael-Addition die namensgebenden Lanthioninringe ausbildet. Diese Lanthioninringe sorgen für eine hohe Stabilität und die antimikrobielle Aktivität von Nisin A. Das modifizierte Pre-peptid wird mittels des ABC-Transporters NisT in den extrazellulären Raum sekretiert und dort von der Protease NisP in seine biologisch aktive Form überführt, indem das Signal-peptid des Kernpeptids abgeschnitten wird. Das resultierende Nisin A ist gegen bestimmte Bakterienstämme in nanomolare Konzentration wirksam. In dieser Arbeit wurde die Stöchiometrie des Modifikationskomplexes von Nisin A untersucht und eine Stöchiometrie von einem NisB Dimer, zu einem Monomer NisC und einem Nisin A Molekül ermittelt. Ebenso konnte mittels Kleinwinkelstreuung (SAXS) der Modifikationskomplex visualisiert werden. Weiterführend konnte der letzte Lanthioninring E als Faktor identifiziert werden, der den Modifikationskomplex destabilisiert und somit seinen Zerfall einleitet. Des Weiteren, wurden diverse Mutationsstudien von Nisin A und natürlich vorkommenden Nisin-varianten durchgeführt. Ziel war es dabei herauszufinden wie sich die einzelnen Mutationen auf die Expression, den Modifikationsstatus der nisin varianten und auch auf die Sekretion auswirken. Die aufgereinigten Varianten wurden dann mittels einer gereinigten NisP Protease in ihre biologisch aktive form überführet. Die Auswirkungen auf die Schneideeffizienz konnten ebenfalls bestimmt werden. Danach war ein wesentlicher Schritt die Untersuchung der biologischen Aktivität auf das Immunitäts-System NisFEG und NisI von Lactococcus lactis, als auch auf das bekannte Resistenz-System NSR und SaNsrFP von Streptococcus agalactiae. Es konnte gezeigt werden, dass alle genutzten Varianten sekretiert und auch posttranslational modifiziert wurden. Eine Variation der Position eins im Kernpeptid, an der ein Isoleucin gegen ein Prolin getauscht wurde, konnte von NisP jedoch nicht mehr geschnitten werden. Es konnte gezeigt werden, dass Mutationen der Position eins im Kernpeptid einen großen Effekt auf die antimikrobielle Aktivität hatten. Insbesondere aromatische Aminosäuren konnten die Aktivität von Nisin A steigern, was ebenfalls mit dem natürlich vorkommenden Nisin H validiert werden konnte, da hier bereits ein Phenylalanin an Position eins vorliegt. Im Rahmen der Untersuchungen konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Nisin variante Cys29Pro von NSR nicht mehr effektiv erkannt wird und somit den Resistenzmechanismus außer Kraft setzten kann. Ebenso zeigte eine Mutante in der Isoleucin und Valin hinter der hinge-Region eingefügt wurden, eine verminderte Erkennung durch alle getesteten Immunitäts- oder Resistenz-Proteine. Nisin A is the model system for lantibiotics. Since its discovery nearly 100 years ago, new naturally occurring variants have been discovered. Nisin A is expressed as a pre-peptide and is post-translationally modified. These modifications are performed by the modification enzymes NisB, which is responsible for the dehydration of serine and threonine residues in the core peptide; and the cyclase NisC, which forms the lanthionine rings via Michael-condensation. These lanthionine rings are responsible for the stability and the antimicrobial activity of nisin A. The modified pre-peptide is secreted via the ABC transporter NisT into the extracellular space, where the protease NisP cleaves off the leader peptide from the core peptide. This results in active nisin A, which is antimicrobial in nanomolar concentrations. In this thesis, the stoichiometry of the modification complex was determined to be a dimer of NisB and a monomer of NisC in complex with one molecule of nisin A. The visualization of the assembled complex was done with small-angle X-ray scattering (SAXS). Furthermore, the lanthionine ring E was found to be a trigger factor for the modification complex, inducing its dissociation. The next focus was to analyze the effect of the different nisin mutations on the secretion and modification machinery. The purified nisin variants were cleaved with a purified soluble version of NisP and the cleavage efficiency was determined. The antimicrobial activity of all variants was tested and benchmarked against the immunity system NisFEG and NisI from Lactococcus lactis as well as the nisin resistance system NSR and SaNsrFP from Streptococcus agalactiae. Here, it was shown that all nisin variants were secreted and post-translationally modified. Only one variant, in which isoleucine at position one was changed to a proline, was not cleaved by NisP. Furthermore, variants with an aromatic residue at position one showed higher antimicrobial activity than other mutations. This even holds true in comparison to the natural nisin H, with a phenylalanine at position one. Intriguingly, the recognition of the variant Cys29Pro by NSR was drastically reduced, resulting in a bypass of this resistance protein. Furthermore, a variant in which an isoleucine and valine were introduced after the hinge region was less recognized by all the tested immunity and resistance proteins.
Lizenz:	Dieses Werk ist lizenziert unter einer Creative Commons Namensnennung - Nicht kommerziell - Keine Bearbeitungen 4.0 International Lizenz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	19.01.2023
Dateien geändert am:	19.01.2023
Promotionsantrag am:	22.11.2022
Datum der Promotion:	22.12.2022